インテグリン阻害薬スクリーニングのためのフローサイトメトリーベースのハイスループット技術

多くの炎症性疾患は、腫れまたは損傷の部位における好中球の浸潤を特徴とする¹。これらの組織に浸潤するために、好中球は、内皮への停止、血管壁を横切る血管外漏出、および組織への動員を含む好中球動員カスケードを完了する^{必要があります2。}循環好中球は、特に停止期において、このカスケードを完了するためにβ2インテグリン活性化を必要とします。したがって、好中球の接着、血管外漏出、および動員を減少させるインテグリン阻害薬は、炎症性疾患を効果的に治療する可能性があります^3,4。

β2インテグリンは、以前から炎症性疾患の標的となっていました。インテグリンαLβ2を直接標的とするモノクローナル抗体であるエファリズマブは、乾癬^の治療薬として開発されました5。しかし、エファリズマブは、JCウイルスの再活性化に起因する進行性多巣性白質脳症という致命的な副作用のために中止されました^6,7。新しい抗炎症インテグリンベースの治療法では、副作用を最小限に抑えるために白血球の抗感染機能を維持することを考慮する必要があります。エファリズマブの副作用は、血流中のモノクローナル抗体の循環が長引くことが原因である可能性があり、長期的には免疫機能を阻害^{する可能性があります8。}最近の研究では、エファリズマブがαLβ2架橋とα4インテグリンの望ましくない内在化を媒介することが示されており、副作用の代替的な説明^{を提供しています9。}したがって、短命の低分子アンタゴニストはこの問題を回避できる可能性があります。

ここでは、ヒト好中球を用いた低分子β2インテグリン拮抗薬のスクリーニングのためのハイスループット法を紹介します。β2インテグリンの活性化は、インテグリンエクトドメインへのアクセスとリガンドへの結合親和性の増加を得るために、インテグリンエクトドメインの立体配座変化を必要とします。正準スイッチブレードモデルでは、ベントクローズドインテグリンエクトドメインは、最初に拡張-閉鎖コンフォメーションまで伸長し、次にそのヘッドピースを完全に活性化された拡張-開放コンフォメーションに開きます10,11,12,13。また、ベントクローズドからベントオープン、エクステンデッドオープン、最終的には14,15,16,17,18,19までの代替経路もあります。コンフォメーション特異的抗体mAb24は、エクトドメインのヘッドピースが開いているときにヒトβ2-I様ドメインのエピトープに結合します20,21,22,23。

ここでは、mAb24-APCを使用して、β2インテグリンが活性化されているかどうかを判断します。好中球とインテグリンを活性化するために、好中球β2インテグリン²⁴を活性化できる細菌由来の短い走化性ペプチドであるN-ホルミルメチオニル-ロイシル-フェニルアラニン(fMLP)をこのプロトコルの刺激として使用します。fMLPが好中球上のFpr1に結合すると、Gタンパク質、ホスホリパーゼCβ、およびホスホイノシチド3-キナーゼγを含む下流のシグナル伝達カスケードが活性化されます。これらのシグナル伝達事象は、最終的に、インサイドアウトシグナル伝達経路を介してインテグリン活性化をもたらす^18,25。β2インテグリンに直接結合し、インテグリン活性化の立体構造変化を防ぐ低分子アンタゴニスト²⁶に加えて、β2インテグリンのインサイドアウト活性化シグナル伝達経路の成分を阻害できる化合物もこの方法で検出されます。自動フローサイトメーターにより、ハイスループットスクリーニングが可能になります。新しいアンタゴニストを同定することで、インテグリン生理学の理解が深まるだけでなく、インテグリンベースの抗炎症療法に関するトランスレーショナルな洞察が得られる可能性があります。