可扩展的3D工程肌肉组织中的临床前药物测试

1. 细胞培养方案 原代人肌母细胞培养在冰上以 1：100 的比例在 8 mL DMEM/F12 培养基中稀释细胞外基质 （ECM）。 将8mL的ECM溶液施入一个T175烧瓶中，并在细胞接种前在37°C下孵育至少1小时，但不超过24小时。确保ECM溶液覆盖整个烧瓶底部。 将 5 mL 骨骼肌生长培养基等分到 15 mL 锥形管中。 在37°C的水浴中解冻冷冻细胞（5.0 x 105 个成肌细胞）2分钟或直到冰刚刚融化。用70%乙醇喷洒小瓶并将其转移到生物安全柜（BSC）中。 使用P1000将细胞转移到等分培养基中。不要磨擦。将细胞以300× g 离心3分钟。 吸出上清液并使用P1000移液管将细胞重悬于1 mL生长培养基中，以获得单细胞悬液。 用 15 mL DPBS 洗涤 ECM 包被的烧瓶。吸出DPBS，然后将30mL生长培养基加入烧瓶中。 向细胞中加入4mL生长培养基，混合并将细胞悬液分配到T-175烧瓶中。确保总体积为 35 mL。将烧瓶沿工作台向左和向右轻轻滑动5-6次，然后向前和向后滑动5-6次，以确保细胞在烧瓶表面上均匀分布。 将T-175烧瓶放入37°C和5%CO2的细胞培养箱中。培养细胞3天或直到它们达到不超过70%的汇合度，然后传代细胞。 传代原代人成肌细胞在冰上以 1：100 的比例在 30 mL DMEM/F12 培养基中稀释 ECM。 将10mL的ECM溶液施用于三个T225烧瓶中，并在细胞接种前在37°C下孵育至少1小时，但不超过24小时。确保ECM溶液覆盖整个烧瓶底部。 用 15 mL DPBS 洗涤细胞。根据供应商的方案吸出并添加解离试剂。 取出细胞后，根据供应商的方案停止反应，并将细胞收集到锥形管中。将细胞以300× g 离心3分钟。 吸出上清液并使用P1000移液管将细胞重悬于1 mL生长培养基中，以获得单细胞悬液。 用15mL DPBS洗涤ECM包被烧瓶。吸出DPBS，然后将40mL生长培养基加入每个T225烧瓶中。 向细胞悬液中加入 14 mL 生长培养基，混合并将 5 mL 细胞悬液分配到每个 T225 烧瓶中。确保每个烧瓶中的总体积为 45 mL。将烧瓶沿工作台面向左和向右轻轻滑动 5-6 次，然后向前和向后滑动 5-6 次，以确保均匀分布。 将烧瓶放入37°C和5%CO2的细胞培养箱中。 培养细胞2-3天或直到它们达到不超过70%的汇合度，然后传代。在每次传代时以 1：3 或 1：4 分裂细胞，并在 3 x 103 和 1 x 104 个细胞/cm2 之间播种。 hiPSC 来源的心肌细胞培养在冰上以 1：60 的比例在 12 mL DMEM/F12 培养基中稀释 ECM。 将1mL的ECM溶液施用于两个6孔板的每个孔中，并在细胞接种前在37°C下孵育至少1小时，但不超过24小时。 在37°C的水浴中解冻冷冻的心肌细胞小瓶2分钟或直到冰刚刚融化。 用70%乙醇喷洒小瓶并将其转移到BSC中。 使用 p1000 移液器将解冻的细胞转移到 50 mL 锥形管中。 用 1 mL 室温 （RT） 电镀培养基冲洗空冷冻管以回收任何剩余细胞。 在90秒的过程中缓慢地将1mL冲洗培养基滴入细胞锥形管中（每5秒一滴）。在缓慢添加培养基期间连续旋转试管以混合细胞。 使用 10 mL 血清移液管将 8 mL 电镀培养基缓慢加入 50 mL 锥形细胞管中。 分配所有培养基后，轻轻上下移液 3 次以彻底混合细胞。使用血细胞计数器和台盼蓝计数细胞。 将细胞在 50 mL 锥形管中以 300 x g 离心 3 分钟。 细胞沉淀后，吸出上清液。 使用 p1000 移液器将 1 mL 电镀介质转移到试管中，并通过缓慢上下移液 3-5 次轻轻分解沉淀。用额外的电镀介质重悬细胞。 在 2 mL 电镀培养基中接种 2-4 x 10 6个细胞的 6 孔板。 用DPBS（2 mL /孔）清洗ECM包被的6孔板。 每孔 2 mL 6 孔板移液 2 mL 细胞悬液。沿着工作台向左和向右轻轻移动板 5-6 次，然后向前和向后移动 5-6 次，以确保细胞在板表面上均匀分布。 将板放入37°C和5%CO2的细胞培养箱中。 对要解冻的所有细胞小瓶重复步骤1.3.3-1.3.16。 接种后第二天更换为3-5 mL（取决于细胞系和密度）的维持培养基，然后每隔一天更换一次培养基。在将细胞浇铸成3D组织之前培养细胞3-4天。 基质细胞培养将30mL的ECM溶液施加到T175烧瓶中，并在细胞接种前在37°C下孵育至少1小时，但不超过24小时。 将 5 mL 基质细胞培养基分装到 15 mL 锥形管中。 在37°C的水浴中解冻冷冻的基质细胞小瓶2分钟或直到冰刚刚融化。 用70%乙醇喷洒小瓶并将其转移到BSC中。 使用 p1000 移液器将 1 mL 基质细胞培养基缓慢添加到小瓶中解冻的细胞中。 将细胞悬液从小瓶转移到锥形管中剩余的解冻培养基中。使用 5 mL 血清移液管混合细胞。上下移液3次。 使用血细胞计数器和台盼蓝计数细胞。不要降低单元格转速。 用 15 mL DPBS 洗涤 ECM 包被的 T175 烧瓶。 将基质细胞以3-4 x 103 细胞/ cm2的密度转移到烧瓶中。将烧瓶沿工作台向左和向右轻轻滑动5-6次，然后向前和向后滑动5-6次，以确保细胞在烧瓶表面上均匀分布。 第二天用 45 mL 加热的基质细胞培养基更换培养基。在将细胞浇铸成3D组织之前培养细胞3-4天。 2. 材料准备 纤维蛋白原注意：重建纤维蛋白原时，请注意最大化纤维蛋白原粉末分层的表面积。在该协议中，使用的稀释剂的量被优化为所用容器的大小，即，刚好使用足够的稀释剂来覆盖培养皿的底部。例如，在 100 mm 培养皿而不是 50 mL 离心管中将 0.5 g 纤维蛋白原层叠在 10 mL PBS 上。最大化稀释剂的表面积将减少重建纤维蛋白原所需的时间，并减少蛋白质的潜在结块。重构将 10 mL PBS 转移到 100 mm 细胞培养皿中，并在细胞培养箱中加热至 37 °C。 将0.5g纤维蛋白原粉末层放在温暖的PBS的整个表面上，并保持在37°C，直到纤维蛋白原完全溶解。这应该不超过2小时。溶解粉末可以轻轻旋转，但不要剧烈摇晃培养皿。 无菌过滤粉末完全溶解后，将溶液通过 100 μm 过滤器并将其收集到 50 mL 锥形管中以去除任何凝胶纤维蛋白原团块。 将过滤后的溶液倒入装有0.2μm过滤器的10mL注射器中。将溶液推入过滤器并将其收集到新的 50 mL 锥形管中。可能需要多次更换过滤器才能对所有 10 mL 溶液进行灭菌。 将300mL无菌纤维蛋白原分装到1.5mL微量离心管中，并储存在-20°C。 根据需要在冰上或4°C下解冻等分试样。避免反复冻融。 凝血酶将 6 mL PBS 和 4 mL diH2O 直接加入一瓶凝血酶 （1 KU） 中，制成 100 U/mL 凝血酶储备溶液。 用0.2μm过滤器过滤灭菌，等分试样，并在-20°C下储存在1.5mL塑料微量离心管中，因为凝血酶吸附到玻璃上。避免反复冻融。 聚亚乙基亚胺溶液注意：爱德华王子岛有毒。使用制造商指定的适当个人防护装备。注意：PEI以50%w/v溶液的形式提供。它非常粘稠，难以移液。从 10% 储备溶液中制备 0.1% 溶液，而不是直接从 50% w/v 溶液中制备溶液。在 50 mL 锥形管中测量 5 mL 50% w/v PEI 溶液。 加入 20 mL diH2O 并混合，得到 10% 储备溶液。这种高度浓缩的储备溶液不能无菌过滤。 要制备用于细胞培养的 0.1% 溶液，使用 500 mL 滤瓶将 5 mL 10% 储备液加入 495 mL diH2O 无菌过滤器中，并在室温下储存不超过 1 周。 戊 二 醛注意：戊二醛是有毒的。使用制造商指定的适当个人防护装备。戊二醛以25%溶液的形式提供。要制备 0.01% 溶液，请将 40 μL 加入 99.6 mL diH2O 无菌过滤器中，并在 4 °C 下储存不超过 1 周。 后期准备将耗材组织铸造套件放入无菌培养罩内。铸造套件包含一个盖子、一个可容纳 24 对柱子的柱子（24 孔板的每个孔一对柱子）和一个包含 24 个铸造孔的专用 24 孔板底部。每个铸造孔在孔底部包含一个沟槽，用于固定细胞/水凝胶组件，并在水凝胶聚合时将它们模制成管状组织（图1B）。 用 1.5 mL/孔的 0.1% PEI 溶液填充 24 孔板的孔，并将柱子放入板中，使每对柱子的尖端浸没。让它静置10分钟，PEI将在柱子上沉积正电荷，以便在组织铸造过程中水凝胶中的蛋白质牢固地附着在柱子上。 用 2 mL/孔的无菌 diH2O 填充第二个 24 孔板的孔并转移柱子。静置1分钟。 在第三个 24 孔板中，用 1.5 mL/孔的 0.01% 戊二醛 （GA） 填充孔并转移柱子。让它静置 30 分钟，GA 会将从 PEI 到柱子的正电荷固定下来。 当柱子位于戊二醛中时，吸出diH 2 O孔，用2 mL /孔的无菌diH 2 O洗涤，吸出并重新填充2mL /孔的无菌diH2O。可以使用新鲜的 24 孔板代替冲洗。 当30分钟结束时，将柱子转移到无菌diH 2 O的2mL /孔中。静置1分钟。 吸出diH 2 O，并加入另外2 mL /孔的无菌diH2O。静置5分钟。 将柱子转移到24孔板中干燥（约15分钟）。 干燥后，重新组装铸件套件。封口膜边缘将盖子和板密封在一起，然后在细胞接种前在4°C下储存长达72小时。更长的存储时间可能是可能的，但尚未经过测试。 3. 组织铸造方案 铸板准备在4°C下预冷组织铸造套件。 将一桶冰转移到平衡计分卡中。在冰上，每孔制备 50 μL 凝血酶溶液（3 μL 凝血酶原液 + 47 μL EMT 培养基）。注意：有关 EMT 介质的详细信息，请参阅步骤 3.2.1。 从冰箱中取出冷却的浇注套件，并将其放在细胞培养罩内的冷块或冰块上。将铸造板平放在冰上，然后将后晶格从铸造板移动到新的无菌 24 孔板中。 将 50 μL 凝血酶溶液移液到铸板的每个预冷孔中。 重新组装套件并将其放回冰箱，直到需要组织铸造。除孔外，在凝血酶的3小时内铸造组织。 细胞制备准备EMT基础培养基，无菌过滤器，然后放在冰上。注意：如果细胞特异性浇注培养基含有FBS，请使用热灭活的FBS，因为它可能与纤维蛋白原相互作用并导致过早聚合。准备心脏 EMT 培养基：加入 500 mL RPMI 培养基、10 mL B27 和 2.5 g 氨基己酸。（可选）加入 10 mM ROCK 抑制剂（仅添加到用于铸造组织的 EMT 培养基中，而不是添加到整个 500 mL 体积中）。 制备骨骼 EMT 培养基：加入 50 mL F10 培养基和 0.25 g 氨基己酸 （ACA） 用于原发性 EMT，0.1 g ACA 用于 iPSC 衍生的 EMT。 将细胞培养级解离试剂加热至37°C。 加热等体积的EMT培养基以稀释解离试剂。注意：使用的蛋白酶完全失活至关重要。活性蛋白酶会干扰3D组织的形成和粘附后。 用PBS洗涤细胞（图1A）。将 2 mL/孔用于 6 孔板。分别使用 6 mL、15 mL 和 15 mL 用于 100 mm 培养皿、T175 烧瓶和 T225 烧瓶。 加入加热的细胞培养级解离试剂以提起细胞并在37°C下孵育5分钟或直到细胞解除。对于心脏培养，请使用 10x 解离试剂。对于基质细胞和骨骼肌成肌细胞，请使用 1x 解离试剂。6 孔板使用 1 mL/孔，100 mm 培养皿使用 3 mL，T175 培养瓶使用 8 mL，T225 培养瓶使用 10 mL。 通过敲击板的侧面每2-3分钟检查一次培养物。 细胞抬起后，将其转移到 50 mL 锥形管中，并用 P1000 移液器研磨以确保单细胞悬液。 用额外的EMT培养基洗涤板或烧瓶以收集剩余的细胞并将它们添加到锥形管中。6 孔板使用 1 mL/孔 EMT 培养基，100 mm 培养皿使用 2 mL，T175 培养瓶使用 5 mL，T225 培养瓶使用 5 mL。 研磨细胞以确保单细胞悬液。 加入EMT培养基以终止解离过程，然后取细胞悬浮液样品以进行细胞计数。6 孔板使用 1 mL/孔，100 mm 培养皿使用 3 mL，T175 培养瓶使用 8 mL，T225 培养瓶使用 10 mL。 以200 x g 离心细胞4分钟。在离心悬浮液的同时，使用血细胞计数器和台盼蓝进行细胞计数。 吸出上清液并将细胞重悬于 5 mL EMT 基培养基中以除去残留的解离试剂。 将细胞以200× g 离心4分钟。吸出上清液并以适当的密度制备细胞悬液。 通过在EMT培养基中添加10%-20%的ECM蛋白来增加3D骨骼肌EMT的寿命和功能14，16。 种子干细胞来源的心肌细胞及其基质细胞分别为每个组织构建体5 x 105 个细胞和7.5 x 104 个细胞。以每个组织构建体 7.5 x 105 个细胞播种骨骼肌成肌细胞。 心脏组织吸出上清液，在EMT培养基中以2.5 x 10 6个细胞/mL的密度重悬基质细胞， 并将它们放在冰上。每个EMT使用30μL这种悬浮液。 吸出上清液并以 8.3 x 10 6个细胞/ mL 的密度在 EMT 培养基中重悬 CM，然后将它们放在冰上。每个 EMT 使用 60 μL 这种悬浮液。 骨骼肌组织吸出上清液，在EMT培养基中以8.3 x 106个细胞 /mL的密度重悬骨骼肌细胞，并将它们放在冰上。每个EMT使用90μL这种悬浮液。 计算构成所需组织数量所需的每种细胞溶液的体积（例如，每个EMT制备的CM为60μL，制备的基质细胞为30μL，骨骼肌细胞为90μL）。 将计算出的细胞体积移液到 15 mL 锥形管中。 每个EMT向细胞悬液中加入10μL纤维蛋白原，并将其放在冰上。 每个 EMT 的总试剂和细胞体积：确保每个 EMT 含有 90 μL 细胞、10 μL 纤维蛋白原和 50 μL 凝血酶溶液。 组织铸造将组织铸造套件转移到细胞培养罩中并取下盖子（包含柔性和刚性柱的柱格应保留在铸造板上; 图 1B）。保持铸板，后晶格平放在冰上。 混合细胞/纤维蛋白原混合物，用 P200 移液器吸取 100 μL。 将 100 μL 混合物加入用 50 μL 凝血酶溶液制备的孔中，并研磨 5 次以充分混合。请勿将移液器推过第一挡，并在研磨后取下吸头，以免产生任何气泡。 在此阶段，直到柱晶格准备好从铸造板上提起（步骤3.3.10），晶格的任何移动都可能损害组织与柱子的长期附着。用一只手的食指和拇指同时握住晶格和铸造孔板，以避免晶格的任何移动。 对每个组织重复一个新的P200尖端，直到所有组织都石膏固定。在 15 mL 锥形管中混合细胞悬液，然后随着细胞快速沉降而浇注每个组织。 小心地将种子套件转移到培养箱中，确保不要移动晶格。播种后晶格的移动可能导致将组织移出铸造孔的成功率降低。在37°C孵育80分钟，无论细胞类型如何。这将开始水凝胶的聚合并允许蛋白质附着在柱子上。 同时，准备一个新鲜的 24 孔板，其中包含 2 mL/孔的 EMT 培养基，用于心脏组织。如果需要，可以将10mM ROCK抑制剂添加到EMT培养基中。将板在37°C孵育以加热培养基。 制备 2 mL/孔的生长培养基，其中含有 5 g/L 氨基己酸（0.2 mm 无菌过滤），用于原代骨骼肌组织，或 2 g/L ACA 用于 iPSC 衍生的 EMT。将板在37°C孵育以加热培养基。 孵育后，轻轻地将1mL的EMT培养基添加到铸孔的边缘，并在37°C下再孵育10分钟，无论细胞类型如何。这将使水凝胶从铸造孔的边缘脱落，并允许组织轻松转移。 10分钟后，小心地提起柱晶格并将组织从铸造板转移到准备好的带有培养基的24孔板中（图1C）。将带有组织的板返回到37°C的细胞培养箱中。 保养24小时后，将管型组织转移到具有2mL /孔EMT培养基的新鲜24孔板中（如果包括ROCK抑制剂，则不含ROCK抑制剂），并在37°C下孵育。 对于骨骼肌细胞，将生长培养基切换到分化培养基以促进肌母细胞融合。 每2-3天将心脏组织转移到具有2mL /孔EMT培养基的新鲜孔中。 每2-3天将骨骼肌组织转移到含有5 g / L氨基己酸（0.2 mm无菌过滤）的2 mL /孔分化培养基的新鲜孔中。将 2 g/L ACA 用于 iPSC 来源的组织。 为了帮助更换培养基，请将后晶格转移到新的 24 孔板中，而不是在同一板中更换培养基以避免损坏 3D 组织。用EMT培养基准备第二个24孔板，并将组织转移到新鲜培养基中。将装有旧培养基的培养基与活性培养物一起保存，以用于下一次培养基更换。在整个培养期间，在两个板之间来回转移柱格。或者，每次更换培养基时使用新鲜板。 通过后偏转的光学跟踪（图1D）或磁传感硬件13，14测量EMT收缩。心脏组织在培养3-4天后开始自发跳动。培养 7 天后，骨骼肌组织通常在电场刺激下收缩。