Medida da Contratilidade Cardíaca em Cardiomiócitos Primários Humanos Isolados

Todos os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentações pertinentes. Todos os corações humanos utilizados para os estudos eram não transplantáveis e eticamente obtidos por consentimento legal informado (primeira pessoa ou parente próximo) de doadores de órgãos cadavéricos nos Estados Unidos (EUA). Os protocolos de recuperação e experimentação in vitro foram pré-aprovados por Comitês de Revisão Institucional (CEPs) em centros transplantadores dentro da US Organ Procurement Transplant Network (OPTN). Além disso, todas as transferências de corações doados são totalmente rastreáveis e periodicamente revisadas pelas autoridades federais dos EUA. NOTA: Aplicar todos os procedimentos de segurança necessários durante a execução deste protocolo, incluindo o uso de equipamentos de proteção individual apropriados (por exemplo, jalecos de laboratório, óculos de segurança, luvas). 1. Isolamento dos cardiomiócitos (1 dia antes da medida da contratilidade) Reperfundir corações de doadores imediatamente na chegada ao laboratório com solução cardioplégica patenteada gelada6 e isolar enzimaticamente miócitos humanos adultos primários dos ventrículos 11,12,13,14,15. Em seguida, manter os cardiomiócitos em suspensão e armazená-los com 10 mL da solução A (sacarose 110 mM, CaCl2 0,005 mM, 2 mM MgCl 2, 70 mM KOH, ácido lactobiônico 60 mM, 10 mM KH 2 PO4, 20 mM taurina, 20 mM L-histidina, 20 mM HEPES, 2 mM L-ácido glutâmico,2 mM L-(-)-ácido málico, pH 7,4 com KOH) em frascos de 20 mL de Wheaton (Tabela de Materiais) em temperatura refrigerada até serem interrogados experimentalmente.NOTA: Armazenar 200.000 células por frasco para injetáveis. 2. Preparação do revestimento de laminina (1 dia antes de medir a contratilidade) Coloque uma única lamínula de vidro (quadrado de 25 mm x 25 mm, Tabela de Materiais) em cada poço de uma placa de cultura de oito poços (Tabela de Materiais). Em seguida, revestir as lamínulas com laminina na concentração de 5 μg/mL. Para isso, adicione 800 μL do estoque de Laminina 521 recombinante humana (Tabela de Materiais, armazenado a −20 °C) a 7,2 mL de solução B (NaCl 145 mM, KCl 4 mM, CaCl2 2,5 mM, MgCl2 1 mM, glicose 11,1 mM e HEPES 10 mM, pH 7,4 com NaOH) e misture bem. Lançar 200 μL da solução de laminina diluída no centro de cada lamínula. Em seguida, tampe o prato e empilha-o em uma geladeira de 4 °C.NOTA: Prepare várias placas de cultura de oito poços para garantir que haja laminina-revestida suficiente. 3. Preparação de cardiomiócitos tolerantes a Ca2+ (no dia da medição da contratilidade) Retire um frasco para injetáveis de células do frigorífico, aspirar a solução A do frasco para injetáveis e adicionar 10 ml refrigerados de solução B.NOTA: Certifique-se de que as células não são aspiradas e disperse a solução B no frasco para injetáveis colocando a pipeta no interior da parte superior da parede do frasco para injetáveis. Tampe o frasco para injetáveis de células e, em seguida, gire suavemente para garantir que as células estão dispersas por toda a solução B. Finalmente, deixe as células se acomodarem por 1 h à temperatura ambiente (TR). 4. Preparação do sistema de registo (no dia da medição da contratilidade) NOTA: O sistema de registro inclui caixa de controle de temperatura, estimulador, perfusão controlada por computador, frascos de perfusão acionados por pressão, software de aquisição interno que permite a seleção de regiões de interesse (ROIs) e exibição de transientes de contratilidade, microscópio invertido, câmara celular e câmera (Figura 1). Ligue o sistema de vácuo de sucção. Em seguida, remova a tampa do microscópio, ligue-a, conecte a câmera (Tabela de Materiais, Figura 1) e, finalmente, confirme se o ventilador está ligado para garantir que a câmera não superaqueça. Em seguida, ligue a placa de aquecimento do microscópio (Tabela de Materiais) e a caixa de controle de temperatura (Tabela de Materiais, Figura 1), e ajuste-as para a temperatura de operação adequada. Em seguida, ligue o estimulador de campo (Tabela de Materiais, Figura 1) e o sistema de pressão. Por fim, conecte a tubulação da solução (Tabela de Materiais) à câmara de registro (Tabela de Materiais, Figura 1). 5. Preparação dos compostos de ensaio (no dia da medição da contratilidade) Dimetilsulfóxido diluído (DMSO; Tabela de Materiais) 1.000 vezes na solução C (NaCl 145 mM, KCl 4 mM, CaCl2 1,8 mM, MgCl2 1 mM, glicose 11,1 mM e HEPES 10 mM, pH 7,4 com NaOH) para fazer uma solução veicular DMSO a 0,1%. Para testar um composto a 1 vez, 10 vezes, 100 vezes e 1000 vezes de sua exposição terapêutica de 0,001 μM, dissolver o composto de teste em DMSO a uma concentração de 1 mM. Diluir esta solução em série com DMSO para produzir mais três stocks de DMSO (por exemplo, 0,001 mM, 0,01 mM e 0,1 mM). Finalmente, diluir cada estoque de composto de teste 1.000 vezes em 100 mL de solução C para obter as concentrações finais de teste (0,001 μM, 0,01 μM, 0,1 μM e 1 μM). Adicionar a solução do veículo e as soluções das concentrações micromolares finais do composto aos frascos de vidro de 100 mL (Tabela de Materiais, Figura 1) e, em seguida, conectar os frascos ao sistema de perfusão acionado por pressão (Tabela de Materiais, Figura 1). Em seguida, prime o sistema de perfusão com um programa computadorizado (Tabela de Materiais) usando uma pressão de 200-300 mbar para fornecer um fluxo de perfusão constante a uma taxa de 1,8 mL/min.NOTA: Não conduza a experiência se se verificar que o composto de ensaio está associado a um problema de solubilidade. Além disso, formular as soluções de teste de compostos a partir de soluções-mãe dentro de 30 minutos antes da aplicação experimental nas células. 6. Plainização dos cardiomiócitos (no dia da medição da contratilidade) Tire uma placa de oito poços contendo laminas revestidas de laminina, para fora da geladeira a 4 °C e coloque cuidadosamente uma tampa em uma câmara de registro muito bem limpa (Figura 1). Em seguida, retorne a placa de oito poços para a geladeira de 4 °C até o próximo revestimento.NOTA: Use um lenço sem fiapos (Tabela de Materiais) para limpar a lamínula revestida, mantendo a lamina revestida em uma fina camada de laminina. Além disso, certifique-se de descartar as lamínulas usadas em um recipiente para materiais perfurocortantes. Em seguida, tome um frasco escalonado de células (passo 3.2) e aspirar a solução B do frasco para injetáveis para atingir o menor volume possível sem perder células (~200 μL). Em seguida, dispense os 200 μL de células na câmara do microscópio de gravação montada no palco de um microscópio invertido (Tabela de Materiais). Deixe as células assentarem na lamínula por 5 min. Enquanto espera que as células se estabeleçam completamente, abra o campo de visão no microscópio e determine se a densidade celular é adequada (~70%) para o início da execução experimental.NOTA: Certifique-se de que a sucção não aspira todas as células se forem dispensados mais de 200 μL. 7. Registro da contratilidade dos cardiomiócitos Após o acabamento do plaqueamento, equilibre as células por 5 min perfundindo-as continuamente com a solução C usando o sistema de perfusão acionado por pressão (Tabela de Materiais). Ajuste a sucção corretamente, ligue a caixa de controle de temperatura e a placa de aquecimento e configure-as para fornecer ~35 °C. Em seguida, estimular as células com tensão supralimiar a uma frequência de estimulação de 1 Hz (pulso bipolar de 3 ms de duração) em um estimulador de campo com um par de fios de platina colocados em lados opostos da câmara conectados a um estimulador de campo. Ajuste a amplitude do pulso estimulador em 1 V e, em seguida, aumente-o até que os cardiomiócitos comecem a gerar ciclos de contração-relaxamento. Use um valor de limite de 1,5x durante todo o experimento.NOTA: Selecione células saudáveis com morfologia em forma de bastonete e estrias claras. Em seguida, ajuste o campo de visão e concentre-se em exibir o maior número possível de células de contração (Figura 2A). Em seguida, exibir as imagens digitalizadas das células dentro do software de aquisição do sistema de registro de contratilidade óptica. Este software utiliza uma câmera de alta resolução e alta taxa de quadros com uma taxa de 150 FPS (Tabela de Materiais, Figura 1) para gravar um fluxo de vídeo contendo vários miócitos no mesmo quadro.NOTA: Isso fornece resolução temporal e espacial suficiente para capturar e medir a dinâmica dos sarcômeros de vários miócitos saudáveis simultaneamente. Os processadores modernos de alta contagem de núcleos são aproveitados para permitir o cálculo paralelo de mudanças no comprimento do sarcômero a partir do fluxo de vídeo em tempo real (dados de densidade óptica são coletados de regiões de interesse definidas pelo usuário [ROI] colocadas sobre as imagens de cardiomiócitos saudáveis e paralelas ao eixo de contração, Figura 2B). Os dados de intensidade óptica mostram bandas claras e escuras correspondentes às linhas Z dos cardiomiócitos (Figura 1, Figura 2C). Finalmente, esses dados são exibidos ao usuário para fins de monitoramento e salvos em um disco para análise posterior (Figura 2C).Evite áreas das células que não estão em foco. Além disso, não posicione as ROIs próximas à borda das células, pois as mudanças na contração das células durante a aplicação de drogas podem fazer com que as ROIs não consigam ler a contração das células. Quando a seleção das ROIs for concluída e as contrações atenderem aos padrões necessários para uso (por exemplo, encurtamento do sarcômero >1%; contração rítmica após aplicação de uma frequência de estimulação de 1 Hz, ausência de eventos arrítmicos), inicie o experimento para avaliar os efeitos de um composto. O protocolo de estimulação e a sequência de aplicação das concentrações de teste do composto são mostrados na Tabela 1. O software de aquisição gerenciará, de forma automatizada, a aquisição e exibição de dados e rotulagem das concentrações de teste e tempo de tratamento.NOTA: Aplicar concentrações de ensaio se a contração permanecer numa amplitude estável durante todo o período do veículo de base. Desqualificar células que exibem um run-up ou run-down. Além disso, certifique-se de que a perfusão seja alterada para as diferentes concentrações de teste ao longo do experimento. Após a conclusão do experimento e armazenamento de dados no servidor, desligue a perfusão e o aquecedor, pare a estimulação, limpe a câmara do microscópio com água destilada, remova a tampa de vidro e seque bem a câmara.NOTA: Limpe bem a câmara, pois isso é fundamental para evitar expor o próximo conjunto de células a qualquer composto prematuramente, invalidando assim quaisquer dados coletados. Em seguida, realizar um novo revestimento de cardiomiócitos e realizar um experimento adicional para obter dados suficientes para completar o teste do composto ou testar um novo composto. 8. Desligando o sistema óptico de gravação de contratilidade Quando o teste diário do(s) composto(s) for concluído, primeiro desligue todos os equipamentos que não são necessários para limpar o sistema e copie os dados para análise off-line. Em seguida, remova os frascos de vidro de 100 mL (Tabela de Materiais) contendo soluções das concentrações finais de teste e substitua-os por frascos de vidro preenchidos no meio do caminho com solução de concentrado RBS 25 (Tabela de Materiais). Perfundir a solução RBS através da câmara do microscópio por 5 min, em seguida, desconectar a tubulação de perfusão da câmara, limpá-la com água destilada e, finalmente, secá-la completamente.NOTA: Certifique-se de que o vácuo está funcionando bem para evitar possíveis inundações. Em seguida, conecte a tubulação de perfusão à tubulação de drenagem. Usando o software do sistema de perfusão acionado por pressão (Tabela de Materiais), execute a solução RBS por 10 min, garantindo que a pressão e a vazão estejam adequadamente ajustadas. Em seguida, perfundir DMSO 1% por 5 min e, em seguida, água destilada por 15-20 min para completar a limpeza do sistema de perfusão. Desligue a luz do microscópio e coloque sua tampa. Em seguida, desconecte os fios da câmera da caixa na lateral do microscópio e desligue o ventilador. Certifique-se de que todos os frascos usados sejam enviados para limpeza e autoclave. Por fim, certifique-se de que todas as caçambas de drenagem estejam 1/4 cheias ou menos.NOTA: Certifique-se de que existem laminínicos suficientes para utilização no dia seguinte. Finalmente, copie os arquivos na pasta de aquisição de todos os experimentos feitos em cada sistema de gravação e cole-os em um servidor de backup seguro para análise offline adicional. Em seguida, exclua todos os arquivos de dados da pasta de aquisição. 9. Análise dos dados de contratilidade Execute a análise off-line usando o software de análise e uma macro personalizada para calcular a média dos dados. O software de análise calcula e reporta várias métricas a partir dos dados dinâmicos do sarcômero produzidos pelo software de aquisição. Uma lista detalhada desses parâmetros é fornecida na Figura 2D.NOTA: A aplicação de técnicas de software de baixo nível permite que muitas execuções de gravações sejam analisadas em 5 s. O principal parâmetro para avaliar as mudanças na contratilidade induzidas por drogas é a amplitude da contratilidade (% de encurtamento do sarcômero = mudança no comprimento do sarcômero). É calculado como o comprimento do sarcômero no pico de contração/comprimento do sarcômero em repouso e calculado a média dos últimos 20 transientes de contratilidade para cada concentração de teste. Quantificar os efeitos do composto de teste na amplitude de contratilidade média em relação à condição de controle do veículo basal específica de cada cardiomiócito. Expresse os resultados médios como média ± MEV e produza um gráfico plotando o efeito da concentração do composto de teste na amplitude de contratilidade. Em seguida, ajuste a curva concentração-resposta à equação de Hill usando um software de análise (Tabela de Materiais) para derivar os valores de IC50 (concentração produzindo uma inibição de 50% da amplitude de contratilidade) e CE50 (concentração produzindo um aumento de 50% na amplitude de contratilidade). Além da amplitude de contratilidade, você também pode calcular outros parâmetros:Pós-contração: Identificar a pós-contração como uma contração secundária espontânea transitória do cardiomiócito que ocorre antes da próxima contração regular e produz uma contração anormal e não sincronizada. Falha de contração: Identificar falha de contração como a incapacidade do estímulo elétrico de induzir uma contração. Variabilidade de curto prazo (STV) e alternans: Visualize esses dois parâmetros em gráficos de Poincaré da variabilidade da amplitude de contração.Calcular o STV (∑|CAn + 1 − CAn| (20 × √2) −1) com os últimos 20 transientes de cada período de concentração dos artigos de controlo e ensaio. Identificar alternâncias como repetitivas, alternando transientes de amplitude de contratilidade curta e longa. Para calcular a incidência de pró-arritmia, normalizar os valores de STV para o valor de controle do veículo de cada célula, plotar pós-contração, falha de contração, STV e alternans, e expressá-los como % da incidência de células exibindo cada um dos sinais. Completar o perfil mecanístico multiparamétrico com o cálculo do tempo Ato pico, decaimento para 30% de relaxamento (Decay 30), decaimento para 90% de relaxamento (Decay 90), tempo para 90% de relaxamento (TR90) (Figura 2D), comprimento basal do sarcômero, tempo para 50% de pico, altura do pico, comprimento do sarcômero no pico de contratilidade, velocidade máxima de contração e velocidade máxima de relaxamento12. Assim como a amplitude de contratilidade, expresse esses parâmetros relativos à condição de controle basal específica de cada cardiomiócito e os represente graficamente em gráficos concentração-resposta.