分离的成人原代心肌细胞心脏收缩力的测量

所有方法均按照相关指南和规定进行。用于研究的所有人类心脏都是不可移植的，并且通过美国尸体器官捐献者的知情法律同意（第一人称或近亲）从道德上获得。恢复方案和 体外 实验由美国器官获取移植网络 （OPTN） 内移植中心的机构审查委员会 （IRB） 预先批准。此外，所有捐献心脏的转移都是完全可追溯的，并由美国联邦当局定期审查。 注意： 在执行本协议期间应用所有必要的安全程序，包括穿戴适当的个人防护设备（例如，实验室外套、安全眼镜、手套）。 1.心肌细胞分离（测量收缩力前1天） 到达实验室后立即用冰冷的专有心脏麻痹溶液6 重新灌注供体心脏，并从心室11、12、13、14、15 中酶促分离成人原代人原代肌细胞。 然后，将心肌细胞保持在悬浮液中，并用10mL溶液A（110mM蔗糖，0.005mM CaCl 2,3mM MgCl 2,70mM KOH，60mM乳糖酸，10mM KH2 PO4,20mM牛磺酸，20mM L-组氨酸，20mM HEPES，2mM L-谷氨酸，2mM L-（-）-苹果酸， pH 7.4 含 KOH）在 20 mL Wheaton 小瓶（材料表）中，在冷藏温度下直至对其进行实验询问。注意：每瓶可储存 200,000 个细胞。 2.层粘连蛋白涂层制备（测量收缩力前1天） 将单个玻璃盖玻片（25 mm x 25 mm正方形，材料表）放入八孔培养板（材料表）的每个孔中。 然后，用浓度为 5 μg/mL 的层粘连蛋白涂覆盖玻片。为此，将800μL人重组层粘连蛋白521原液（材料表，储存在-20°C）中加入7.2mL溶液B（145mM NaCl，4mM KCl，2.5mM CaCl 2,1mM MgCl2,11.1mM葡萄糖和10mM HEPES，pH 7.4与NaOH）并充分混合。 将 200 μL 稀释的层粘连蛋白溶液滴入每个盖玻片的中心。然后，盖上盘子并将其堆叠在4°C冰箱中。注意：准备多个八孔培养板，以确保有足够的层粘连蛋白包被的盖玻片。 3.制备耐Ca2+的心肌细胞（测量收缩力当天） 从冰箱中取出一小瓶细胞，从小瓶中吸出溶液 A，然后加入冷藏的 10 mL 溶液 B。注意：通过将移液器放在样品瓶壁顶部的内侧，确保细胞没有被抽吸并将溶液B分散到样品瓶中。 盖上细胞瓶盖，然后轻轻旋转以确保细胞分散在整个溶液B中。最后，让细胞在室温（RT）下沉降1小时。 4.记录系统的准备（在测量收缩力的当天） 注：记录系统包括温度控制箱、刺激器、计算机控制的压力驱动灌注、压力驱动的灌注瓶、允许选择感兴趣区域 （ROI） 和显示收缩性瞬变的内部采集软件、倒置显微镜、细胞室和相机（图 1）。 打开抽吸真空系统。然后，取下显微镜盖，打开它，连接相机（材料表， 图1），最后，确认风扇已打开，以确保相机不会过热。 然后，打开显微镜加热板（材料表）和温度控制箱（材料表，图1），并将它们设置为适当的工作温度。接下来，打开场刺激器（材料表，图 1）和压力系统。最后，将溶液的管道（材料表）连接到记录室（材料表，图1）。 5.测试化合物的制备（在测量收缩力的当天） 稀二甲基亚砜（DMSO;材料表）在溶液C（145 mM NaCl、4 mM KCl、1.8 mM CaCl 2、1 mM MgCl2、11.1 mM 葡萄糖和10 mM HEPES，pH 7.4 with NaOH）中1,000倍，制成0.1%DMSO载体溶液。 要以 0.001 μM 治疗暴露量的 1 倍、10 倍、100 倍和 1000 倍测试化合物，将测试化合物以 1 mM 的浓度溶解在 DMSO 中。 用DMSO连续稀释该溶液，再产生三种DMSO储备液（例如，0.001mM、0.01mM和0.1mM）。最后，在 100 mL 溶液 C 中将每种测试化合物原液稀释 1,000 倍以获得最终测试浓度（0.001 μM、0.01 μM、0.1 μM 和 1 μM）。 将载体溶液和化合物最终微摩尔浓度的溶液加入100mL玻璃瓶中（材料表，图1），然后将瓶子连接到压力驱动的灌注系统（材料表，图1）。 然后，使用 200-300 mbar 的压力使用计算机驱动的程序（材料表）灌注灌注系统，以 1.8 mL/min 的速率提供恒定的灌注流量。注意：如果发现测试化合物与溶解度问题有关，请勿进行实验。此外，在实验应用于细胞之前30分钟内从储备溶液中配制化合物测试溶液。 6.心肌细胞的铺板（在测量收缩力的当天） 从4°C冰箱中取出一个含有层粘连蛋白涂层盖玻片的八孔板，并小心地将一个盖玻片放入清洁良好的记录室中（图1）。然后，将八孔板放回4°C冰箱，直到下一次铺板。注意： 使用无绒擦拭布（材料表）擦拭涂层盖玻片，同时保持盖玻片涂有一层薄薄的层粘连蛋白。此外，确保将用过的盖玻片丢弃在锐器容器中。 然后，取一瓶递增的细胞（步骤3.2）并从小瓶中吸出溶液B，以达到尽可能小的体积而不会丢失细胞（~200μL）。接下来，将 200 μL 细胞分配到安装在倒置显微镜载物台上的记录显微镜室中（材料表）。 让细胞在盖玻片上沉淀5分钟。在等待细胞完全沉降的同时，打开显微镜上的视野，并确定细胞密度是否足以（~70%）开始实验运行。注意：如果分配的细胞超过 200 μL，请确保抽吸不会吸出所有细胞。 7. 记录心肌细胞收缩力 电镀完成后，使用压力驱动的灌注系统（材料表）连续用溶液C灌注细胞，使细胞平衡5分钟。正确调整吸力，打开温控箱和加热板，并将它们设置为提供~35°C。 然后，在场刺激器上以1Hz起搏频率（持续时间为3ms的双极性脉冲）用超阈值电压刺激细胞，其中一对铂线放置在连接到场刺激器的腔室的相对两侧。 将刺激脉冲的振幅设置为1 V，然后增加它，直到心肌细胞开始产生收缩 – 松弛循环。在整个实验过程中使用 1.5 倍阈值。注意：选择具有杆状形态和清晰条纹的健康细胞。然后，调整视野并专注于将尽可能多的收缩细胞带入视野（图2A）。 接下来，在光学收缩力记录系统的采集软件中显示细胞的数字化图像。该软件利用速率为 150 FPS 的高分辨率、高帧率相机（材料表， 图 1）在同一帧中录制包含多个肌细胞的视频流。注：这提供了足够的时间和空间分辨率，可以同时捕获和测量几个健康肌细胞的肌节动力学。利用现代高核心数处理器，可以实时并行计算视频流中肌节长度的变化（光密度数据是从放置在健康心肌细胞图像上并平行于收缩轴的用户定义感兴趣区域 [ROI] 收集的， 图 2B）。光强度数据显示对应于心肌细胞Z线的明带和暗带（图1， 图2C）。最后，这些数据显示给用户用于监控目的，并保存到磁盘中以供以后分析（图2C）。避开未聚焦的单元格区域。此外，不要将ROI放置在靠近细胞边缘的位置，因为在施用药物期间细胞收缩的变化会导致ROI无法读取细胞的收缩。 当ROI的选择完成并且收缩符合必要的使用标准（例如，肌节缩短>1%;应用1 Hz起搏频率时出现节律性收缩，没有心律失常事件），开始实验以评估化合物的效果。刺激方案和化合物应用测试浓度的顺序如 表1所示。采集软件将以自动化方式管理数据的采集和显示，以及测试浓度和处理时间的标记。注意： 如果在整个基线车辆周期内收缩保持稳定幅度，则应用测试浓度。取消显示上升或下降的单元格的资格。 此外，确保在整个实验过程中将灌注切换到不同的测试浓度。 在服务器上完成实验和数据存储后，关闭灌注和加热器，停止刺激，用蒸馏水清洁显微镜室，然后取出玻璃盖玻片，彻底干燥室。注意：彻底清洁腔室，因为这对于避免下一组细胞过早暴露于任何化合物至关重要，从而使收集到的任何数据无效。 接下来，对心肌细胞进行新的铺板，并进行额外的实验，以获得足够的数据来完成化合物的测试或测试新化合物。 8. 关闭光学收缩力记录系统 完成化合物的日常测试后，首先关闭所有不需要清洁系统的设备，并复制数据以进行离线分析。 接下来，取出含有最终测试浓度溶液的 100 mL 玻璃瓶（材料表），并用装有 RBS 25 浓缩溶液（材料表）的玻璃瓶代替。将RBS溶液灌注通过显微镜室5分钟，然后从室中断开灌注管，用蒸馏水清洁，最后彻底干燥。注意： 确保真空工作正常，以防止任何可能的洪水。 接下来，将灌注管连接到引流管。使用压力驱动灌注系统软件（材料表），运行 RBS 溶液 10 分钟，同时确保压力和流速设置充分。然后，灌注1%DMSO5分钟，然后蒸馏水15-20分钟，完成灌注系统的清洁。 关闭显微镜灯并盖上盖子。然后，从显微镜侧面的盒子上拔下相机线并关闭风扇。确保所有用过的瓶子都送去清洁和高压灭菌。最后，确保所有排水桶都装满了 1/4 或更少。注意：确保有足够的层粘连蛋白涂层盖玻片供第二天使用。 最后，将每个记录系统上完成的所有实验的采集文件夹中的文件复制出来，并将它们粘贴到安全的备份服务器中，以便进行额外的离线分析。接下来，从采集文件夹中删除所有数据文件。 9. 收缩性数据分析 使用分析软件和自定义宏执行离线分析，以对数据进行平均。分析软件根据采集软件生成的肌节动力学数据计算并报告各种指标。 图 2D 提供了这些参数的详细列表。注意：低级软件技术的应用允许在 5 秒内分析多次记录。评估药物诱导的收缩力变化的主要参数是收缩力幅度（肌节缩短百分比 = 肌节长度变化）。它计算为峰值收缩/静息肌节长度时的肌节长度，并在每个测试浓度的最后 20 次收缩力瞬变中取平均值。 量化测试化合物对相对于每个心肌细胞的特定基线载体控制条件的平均收缩力振幅的影响。 将平均结果表示为SEM±平均值，并生成绘制测试化合物浓度对收缩力振幅的影响的图表。接下来，使用分析软件（材料表）将浓度-响应曲线拟合到Hill方程，以得出IC50（浓度产生50%的收缩力振幅抑制）和EC50（浓度产生50%的收缩力振幅增加）值。 除了收缩力振幅外，还可以计算其他参数：后收缩：将后收缩确定为心肌细胞的自发性继发性继发性收缩，发生在下一次规律性收缩之前，并产生异常和不同步的收缩。 宫缩失败：将宫缩失败识别为电刺激无法诱发收缩。 短期变异性 （STV） 和交替性：在收缩幅度变异性的庞加莱图中可视化这两个参数。计算 STV （∑|CAn + 1 − CAn|（20 × √2）−1）每个对照和测试物品浓度周期的最后 20 个瞬态。将交替识别为重复交替的短和长收缩力振幅瞬变。 为了计算致心律失常的发生率，将STV值归一化为每个细胞的载体控制值，绘制收缩后，收缩失败，STV和交替状态，并将它们表示为表现出每个信号的细胞发生率的百分比。 通过计算时间 Ato 峰、衰减至 30% 弛豫 （Decay 30）、衰减至 90% 弛豫 （Decay 90）、达到 90% 弛豫的时间 （TR90）（图 2D）、基线肌节长度、达到 50% 峰的时间、峰高、收缩力峰值时的肌节长度、最大收缩速度和最大松弛速度12.与收缩力振幅一样，表达这些参数相对于每个心肌细胞的特定基线控制条件，并将它们绘制在浓度-响应图中。