Superresolutiemicroscopie kan een gedetailleerd inzicht geven in de organisatie van componenten binnen het synaptonemale complex bij meiose. Hier demonstreren we een protocol om individuele eiwitten van het Caenorhabditis elegans synaptonemale complex op te lossen.
Tijdens meiose moeten homologe chromosomen elkaar herkennen en aan elkaar hechten om hun juiste segregatie mogelijk te maken. Een van de belangrijkste gebeurtenissen die de interactie van homologe chromosomen veilig stelt, is de assemblage van het synaptonemale complex (SC) in meiotische profase I. Hoewel er weinig sequentie homologie is tussen eiwitcomponenten binnen de SC bij verschillende soorten, is de algemene structuur van de SC sterk bewaard gebleven tijdens de evolutie. In elektronenmicrografieën verschijnt de SC als een drieledige, ladderachtige structuur die bestaat uit laterale elementen of assen, dwarsfilamenten en een centraal element.
Het nauwkeurig identificeren van de lokalisatie van individuele componenten binnen het complex door elektronenmicroscopie om de moleculaire structuur van de SC te bepalen, blijft echter een uitdaging. Fluorescentiemicroscopie daarentegen maakt de identificatie van individuele eiwitcomponenten binnen het complex mogelijk. Omdat de SC echter slechts ~ 100 nm breed is, kan de substructuur niet worden opgelost door diffractiebeperkte conventionele fluorescentiemicroscopie. Het bepalen van de moleculaire architectuur van de SC vereist dus superresolutie lichtmicroscopietechnieken zoals gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM), gestimuleerde emissiedepletie (STED) microscopie of lokalisatiemicroscopie met één molecuul (SMLM).
Om de structuur en interacties van individuele componenten binnen de SC te behouden, is het belangrijk om het complex te observeren in een omgeving die dicht bij zijn oorspronkelijke omgeving in de geslachtscellen ligt. Daarom demonstreren we een immunohistochemie- en beeldvormingsprotocol dat de studie van de onderstructuur van de SC in intact, geëxtrudeerd Caenorhabditis elegans kiembaanweefsel met SMLM- en STED-microscopie mogelijk maakt. Het direct fixeren van het weefsel aan de coverslip vermindert de beweging van de monsters tijdens beeldvorming en minimaliseert aberraties in het monster om de hoge resolutie te bereiken die nodig is om de substructuur van de SC in zijn biologische context te visualiseren.
Het halveren van het aantal chromosomen tijdens meiose is de sleutel tot het genereren van gezonde nakomelingen in seksueel reproducerende organismen. Om deze vermindering van het aantal chromosomen te bereiken, moeten homologe chromosomen paren en scheiden tijdens meiose I. Om de nauwkeurige segregatie van homologe chromosomen te garanderen, ondergaan geslachtscellen een uitgebreide profase I, waarbij homologe chromosomen paren, synapsen en recombineren om fysieke verbindingen tussen homologen te genereren1. De SC is naar voren gekomen als de centrale structuur die de sleutel is tot het reguleren van de juiste progressie door meiotische profase2.
De SC is een complex waarvan de algemene structuur evolutionair geconserveerd is, ook al is er weinig homologie tussen de eiwitcomponenten. De SC werd voor het eerst geïdentificeerd in elektronenmicrografieën als een drietiende, ladderachtige structuur bestaande uit twee laterale elementen of assen, een centraal gebied gevormd door dwarsfilamenten en een centraal element 3,4. Het bepalen van de organisatie van individuele componenten binnen het complex is de sleutel tot het bevorderen van ons begrip van de rol van de SC tijdens de meiotische profase.
Het modelorganisme C. elegans is bij uitstek geschikt om de structuur en functie van de SC te bestuderen, omdat de kiembanen een groot aantal meiotische kernen met volledig geassembleerde SC’sbevatten 5. Genetische en biochemische studies hebben aangetoond dat de chromosoomassen worden gevormd door drie verschillende cohesinecomplexen 6,7 en vier HORMA-domeineiwitten genaamd HTP-1/2/3 en HIM-3 7,8,9,10,11 in C. elegans. In het centrale gebied van de SC zijn tot op heden zes eiwitten met coiled-coil-domeinen geïdentificeerd 12,13,14,15,16,17. Om de afstand tussen de twee assen te overbruggen, dimmen SYP-1, -5 en -6 op een head-to-head manier (figuur 1), terwijl drie extra eiwitten hun interactie stabiliseren in het centrale element 16,17,18,19.
Het verkrijgen van gedetailleerd inzicht in de organisatie van deze eiwitten is essentieel bij het begrijpen van de vele functies van de SC tijdens meiose. Aangezien de breedte van het centrale gebied van de SC slechts ~ 100 nm is, kan de substructuur niet worden opgelost door diffractie-beperkte fluorescentiemicroscopie. Het visualiseren van componenten binnen een structuur van deze grootte is echter gemakkelijk haalbaar door microscopie met superresolutie. Inderdaad, gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM), expansiemicroscopie20, gestimuleerde-emissiedepletie (STED) microscopie21 en single-molecule lokalisatiemicroscopie (SMLM)22,23 zijn naar voren gekomen als essentiële hulpmiddelen om de moleculaire architectuur van de SC te bestuderen over soorten 16,24,25,26,27,28,29, 30.
Om de resolutielimiet te overwinnen, vertrouwt STED-microscopie op het bedekken van de diffractie-beperkte plek van het emissielicht met een donutvormige straal van de STED-laser, die theoretisch de puntspreidingsfunctie beperkt tot moleculaire dimensies 31,32. De resolutie die praktisch haalbaar is door STED binnen biologische monsters blijft echter in het bereik van enkele tientallen nanometers in xy33.
Een nog hogere resolutie in biologische monsters kan worden verkregen met SMLM-technieken. SMLM maakt gebruik van de knipperende eigenschappen van specifieke fluoroforen om objecten op subdiffractieniveau op te lossen door ruimtelijk overlappende fluoroforen in de tijd te scheiden. Het monster wordt vervolgens herhaaldelijk in beeld gebracht om verschillende subsets van fluoroforen vast te leggen. De positie van de fluoroforen in het monster wordt vervolgens bepaald door de puntspreidingsfunctie (PSF) aan te passen aan de verkregen signalen over alle beelden, die structuren tot 15 nm23,34 kunnen oplossen.
Samen coderen de gelokaliseerde afbeeldingen de posities van alle fluoroforen. De resolutie van SMLM wordt bepaald door de labelingdichtheid en de knipperende eigenschappen van de fluorofoor. Volgens het Nyquist-Shannon-criterium is het onmogelijk om objecten betrouwbaar op te lossen die minder dan twee keer de gemiddelde label-to-label afstand hebben. Er is dus een hoge labelingsdichtheid nodig voor beeldvorming met hoge resolutie. Voor de SC in C. elegans kan een hoge labelingsdichtheid worden bereikt door epitooptags te gebruiken die zijn bevestigd aan specifieke plaatsen van endogene eiwitten met behulp van genoombewerking. De epitooptags kunnen vervolgens met een hoge dichtheid worden gekleurd met behulp van specifieke monoklonale antilichamen met hoge affiniteiten19,30. Tegelijkertijd moet de on-cycle van individuele fluoroforen kort genoeg zijn om ervoor te zorgen dat ruimtelijk overlappende fluoroforen niet tegelijkertijd worden opgevangen35.
Vanwege deze twee vereisten vereist het oplossen van de structuur van grote macromoleculaire complexen zoals de SC het afbeelden van een voldoende groot aantal afbeeldingen en kan dus enkele uren duren. De valkuil van lange beeldvormingstijden is dat monsters de neiging hebben om te drijven als gevolg van beweging van het stadium of kleine stromen binnen de monsterbuffer; zelfs kleine bewegingen in de orde van grootte van 10 nm zijn schadelijk bij nm-resolutie en moeten worden gecorrigeerd. De meest gebruikte driftcorrectiemethoden zijn echter niet robuust genoeg om afbeeldingen van twee kanalen die achtereenvolgens zijn afgebeeld nauwkeurig te bedekken36. Dit is problematisch omdat biologische vragen vaak vragen om nauwkeurige detectie en lokalisatie van meerdere doelen binnen dezelfde steekproef. Om deze problemen te omzeilen, zijn methoden zoals ratiometrische beeldvorming ontwikkeld. Ratiometrische beeldvorming maakt de gelijktijdige beeldvorming van meerdere fluoroforen met overlappende excitatie- en emissiespectra mogelijk, met een daaropvolgende toewijzing van elk gedetecteerd signaal aan zijn respectieve fluorofoor op basis van de verhouding van intensiteiten in spectraal verschillende kanalen37,38.
Bovendien vereist het bestuderen van de organisatie van macromoleculaire complexen zoals de SC driedimensionale (3D) informatie. Om een superresolutie in drie dimensies (3D-SMLM) te bereiken, is een cilindrische lens opgenomen in het optische pad van het uitgezonden licht dat de vorm van de PSF van een fluorofoor vervormt, afhankelijk van de afstand tot het brandpuntsvlak. Daarom kan de precieze positie van een fluorofoor in het z-vlak worden geëxtrapoleerd door de vorm van zijn emissiesignaal35,39 te analyseren. Het combineren van deze vooruitgang in SMLM maakt beeldvorming mogelijk van de 3D-organisatie van macromoleculaire complexen, inclusief de SC.
De ladderachtige organisatie van de SC, die essentieel is voor de juiste recombinatie en segregatie van homologe chromosomen, werd bijna 70 jaar geleden voor het eerst waargenomen in elektronenmicroscopie 3,4. Hoewel de algehele organisatie van de SC gemakkelijk wordt opgelost in elektronenmicroscopie, vereist de lokalisatie van individuele componenten binnen dit complex een meer gerichte aanpak. Met zijn breedte van slechts ~ 100 nm kan de onderbouw van de SC niet worden opgelost door conventionele fluorescentiemicroscopie. Superresolutiemicroscopie is echter een belangrijke drijfveer geworden voor nieuwe ontdekkingen over de structuur en functie van het synaptonemale complex 16,19,24,25,26,27,28,29,30. Om dit onderzoek te vergemakkelijken, hebben we een montageprocedure gedemonstreerd die het mogelijk maakt om de architectuur van de SC in C. elegans gonadweefsel te bestuderen met SMLM en STED-microscopie.
Een cruciale stap om de resolutie in SMLM-beeldvorming te optimaliseren, is het direct koppelen van het kiembaanweefsel aan een poly-L-lysine gecoate coverslip (stap 4). De covalente hechting van het weefsel aan de coverslip is essentieel om bewegingen in het monster te verminderen die zouden resulteren in grote driften en beeldvorming gedurende lange perioden voor SMLM onmogelijk zouden maken. Bovendien leidt zelfs een suboptimale hechting die de kernen met SC’s op een afstand van de coverslip verlaat, tot een aanzienlijke daling van de haalbare resolutie als gevolg van bolvormige aberraties (figuur 4). Als alternatief voor de hier gebruikte covalente aanhechting, kan gekleurd kiembaanweefsel ook worden geïmmobiliseerd tussen twee verzegelde coverslips in een kleine druppel beeldvormingsbuffer19,30. Deze immobilisatiemethode vermindert echter het volume van de beeldvormingsbuffer in het monster ernstig van 1 ml die hier in het geoptimaliseerde protocol wordt gebruikt tot slechts enkele μL, wat zal resulteren in een verzuring van de beeldvormingsbuffer en de tijd waarvoor het monster kan worden afgebeeld ernstig verkort 38,53,54.
Lange acquisitietijden voor zowel SMLM- als STED-microscopie beperken het gebruik van deze methoden tot beeldvorming van chemisch vaste monsters. Hier zorgt paraformaldehydefixatie ervoor dat de structuur van de SC behouden blijft tijdens de monstervoorbereiding en beeldvorming. Ondanks de voorzorgsmaatregelen die hier zijn genomen om de SC in intact weefsel in beeld te brengen, is de resulterende structuur van de SC na fixatie echter niet noodzakelijkerwijs identiek aan de structuur in zijn oorspronkelijke staat in een levend organisme. Bovendien, aangezien een enkele afbeelding van de vaste SC een enkele “momentopname” van de biologische structuur vertegenwoordigt, blijft deze benadering blind voor de dynamiek van de inheemse structuur in vivo.
Informatie over de dynamiek en variabiliteit van macromoleculaire structuren kan echter ook worden verkregen door niet slechts één maar vele “snapshots” te verkrijgen. Hoewel deze aanpak veranderingen in de structuur van de SC tijdens pachyteen19 kan oplossen, zijn er verschillende factoren die het aantal afbeeldingen beperken dat kan worden verkregen uit een enkel monster dat met behulp van dit protocol is voorbereid. Ten eerste leiden de hoge laservermogens die worden gebruikt tijdens beeldacquisitie tot permanent bleken van de fluoroforen en sluiten ze beeldvorming van aangrenzende interessegebieden of meerdere z-vlakken uit, waardoor het aantal beelden dat uit een enkel monster kan worden verkregen, aanzienlijk wordt verminderd. Ten tweede is de monster-/weefseldichtheid op de coverslip die met deze methode is voorbereid laag, wat het aantal afbeeldingen dat kan worden verkregen uit een enkele coverslip aanzienlijk beperkt. De lage monsterdichtheid verbiedt ook het gebruik van geautomatiseerde beeldacquisitiepijplijnen die licht hebben geworpen op andere biologische vragen 34,55,56,57,58,59. De monsterdichtheid kan echter iets worden verhoogd door een ervaren gebruiker.
Het hier gepresenteerde protocol is geoptimaliseerd om een hoge labelingsdichtheid te verkrijgen die nodig is om een optimale resolutie in SMLM35 te bereiken. Terwijl eerdere protocollen het weefsel covalent hechten aan de coverslip vóór immunostaining16, koppelt dit nieuwe protocol het weefsel pas aan de coverslip nadat de monsters in oplossing zijn gekleurd. Deze modificatie zorgt ervoor dat de antilichamen die worden gebruikt voor immunolabeling van alle kanten vrij toegang hebben tot het weefsel, terwijl de covalente hechting van het weefsel aan de coverslip kan voorkomen dat antilichamen de kernen bereiken die zich het dichtst bij de coverslip bevinden, waardoor de mate van etikettering wordt verminderd. Samen verbeteren de hier beschreven wijzigingen de resolutie van 40-50 nm (FRC-resolutie)16 tot 30-40 nm (dit protocol).
Belangrijk is dat, hoewel een hoge labelingsdichtheid en een hoge concentratie antilichamen essentieel is voor SMLM, we ontdekten dat betere STED-microscopiebeelden worden verkregen met behulp van lagere antilichaamconcentraties (stap 3). Met een resolutie van tientallen nanometers wordt de grootte van de moleculen die worden gebruikt om het eiwit van belang te labelen steeds belangrijker. We gebruikten daarom F(ab’)2-fragmenten die half zo groot zijn als antilichamen over de volledige lengte. De verbetering van het lokale contrast als gevolg van een kleinere signaalbron, en dus de resolutie die door deze wijziging werd verkregen in vergelijking met het gebruik van secundaire antilichamen over de volledige lengte, maakte de resolutie van de twee C-termini van SYP-5 binnen het centrale gebied door TauSTED mogelijk, die niet worden opgelost door conventionele STED met behulp van antilichamen over de volledige lengte (16 en gegevens niet getoond). We verwachten dat dit geoptimaliseerde protocol voor het in beeld brengen van SC’s in intacte C. elegan-kiembanenhet onderzoeken van de structuur-functierelatie van de SC tijdens meiose zal vergemakkelijken.
The authors have nothing to disclose.
We willen Jonas Ries en het Ries-lab bedanken voor het delen van imagingbuffers voor SMLM-beeldvorming. We bedanken ook Yumi Kim voor de C. elegans-stam die in dit protocol wordt gebruikt en Abby F. Dernburg voor het kip-anti-HTP-3-antilichaam. We bedanken Marko Lampe en Stefan Terjung van de Advanced Light Microscopy Facility bij EMBL Heidelberg voor hun steun bij het gebruik van de Olympus iXplore SPIN SR confocale microscoop. Dit werk werd ondersteund door het European Molecular Biology Laboratory en de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation – 452616889, SK). We erkennen de toegang en diensten van het Imaging Centre van het European Molecular Biology Laboratory (EMBL IC), genereus ondersteund door de Boehringer Ingelheim Foundation.
100x/1.5 oil objective | Olympus | UPLAPO100XOHR | UPLAPO100XOHR |
2-mercaptoethylamine (MEA) | Sigma-Aldrich | 30070-10G | Dissolved in MilliQ water to 5 M solution, pH 8.7 adjusted with HCl. Aliquoted to a single-use volume, frozen, and kept at -80 °C. |
Additional 640 nm booster laser | Toptica | IBEAM-SMART-640-S-HP | |
AlexaFluor 594, NHS ester | ThermoFischer Scientific | A37572 | Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
AlexaFluor 647, NHS ester | ThermoFischer Scientific | A37573 | Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
anti-HA | Thermo Fisher Scientific | 2-2.2.14 | Mouse monoclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
anti-HTP-3 | a gift from Abby F. Dernburg | MacQueen et al., 2005 | Chicken polyclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
Caenorhabditis elegans strain YKM349 | a gift from Yumi Kim | Hurlock et al., 2020 | syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II |
CF6680, NHS ester | Biotium | 92139 | Dissolved in DMSO to 1mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
Circular cover glass 12 mm No. 1 | Menzel-Gläser; VWR | 631-0713 | |
Circular cover glass 24 mm No. 1.5 | Carl Roth | PK26.1 | |
Cylindrical lenses | Thorlabs | LJ1516RM-A, LK1002RM-A | |
Egg Buffer (10x) | Edgar 1995 | 250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4 | |
Ethanol (absolute for analysis) | Merck | 64-17-5 | |
F(ab’)2 fragment anti-chicken IgY | Jackson Immunoresearch | AB_2340347 | Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
F(ab’)2 fragment anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | AB_2340761 | Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
Fisherbrand Microscope slides T/F Ground 0.8-1.0 mm thick | Fisher scientific | 7107 | |
Gauge Worm Pick 30 diameter 0.254 mm – Iridium 10% | Kisker | 789265 | |
Glucose oxidase/Catalase enzyme mix (GlOX/Cat ) | a gift from Jonas Ries | Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 | 20x, 1916 U/mL glucose oxidase (Sigma G7141), 42350 U/mL catalase (Sigma C3155), 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 51% glycerol, MilliQ water. Stored at -20 °C. |
Imaging buffer base | a gift from Jonas Ries | Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 | 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 10% D-Glucose. Aliquoted to a single-use volume (950 μL), frozen, and kept at -80 °C. |
Invitrogen ProLong Glass Antifade Mountant | ThermoFischer Scientific | P36982 | |
Leica Stellaris 8 STED FALCON | Leica | N/A | The microscope is equiped with the latest generation white light laser, a 775nm pulsed STED laser, the FALCON Fluorescence Lifetime IMaging module, HC PL APO CS2 100x/1.40 oil objective, and Leica HyD X detector. The system is capable of FLIM module enhanced Tau-STED which measures the specific fluorescence lifetime of a dye and is therefore capable of removing background signal based on differences in fluorescence lifetimes of the dyes, and dye conditions in the sample. Additionally, the resolution is increased by accounting for the variation of fluorescence lifetimes in different areas of the depletion donut. |
Longwave channel emission filter | AHF Analysentechnik | F47-702 | 700/100 nm bandpass |
Methanol (absolute for analysis) | Merck | 67-56-1 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich/Merck | S5761-500G | 100 mM NaHCO3, pH 8.3 |
Near-infrared fiber-coupled laser | Toptica | IBEAM-SMART-PT-CD | Custom Design, 808 nm – 75mW |
Objective lens piezo mount (PIFOC ) | Physik Instrumente | P-726.1.CD | 100 µm travel range |
Orca Fusion BT sCMOS camera | Hamamatsu | C15440-20UP | |
PCR tubes | Greiner Bio-One | 673283 | 0.2 mL |
Phosphate Saline Buffer (PBS 10x) | N/A | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 | |
Pierce 16% formaldehyde (w/v), methanol free | ThermoFischer Scientific | 28906 | 16% formaldehyde is transferred from the original glass ampule into 1.5 mL tube and kept at room temperature. |
PlasmaPrep2 plasma cleaner | GaLa Instrumente GmbH | N/A | |
Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich/Merck | P2636-25MG | 0.1% w/v solution was prepared in Milli-Q water, and stored in aliquots at -20 °C. |
Primary dichroic (illumination reflecting) | AHF Analysentechnik | F73-866S | quad bandpass @ 405, 488, 561, 640 |
Quadnotch filter | AHF Analysentechnik | F40-072 | 405/488/561/640 nm |
Quadrant photodiode (QPD) | Laser Components | SD197-23-21-041, LC301DQD-PV | |
Razor blades | Apollo Herkenrath Solinger | N/A | |
Refractive beam shaper | AdlOptica | PiShaper 6_6_VIS | |
Roche Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | 10x solution was prepared according to recommendation. Frozen aliquots were stored at -20 °C. |
Scalpel blade (Feather brand #11, No. 3) | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1110911 | |
Scalpel removal box | Fisher scientific | 10002-50 | |
Secondary dichroic (emission reflecting) | AHF Analysentechnik | F38-785S | 750 nm longpass |
Shortpass filter | Semrock | BSP01-785R-25 | 750 nm |
Shortwave channel emission filter | AHF Analysentechnik | F37-677 | 676/37 nm bandpass |
Single molecule localization microscope | EMBL Imaging Centre | Diekmann et al., 2020 with modifications | The microscope provides widefield epi-illumination via a single-mode fiber-coupled laser engine, additional booster laser, and refractive beam shaper to provide a uniform illumination field (Stehr et al, 2019). Widefield images are captured on a sCMOS camera and appropriate relay optics for a system magnification of 61x and a pixel size of 106 nm. For ratiometric imaging of spectrally overlapping far-red dyes, an image splitter produces two spectrally distinct images on the camera (splitting dichroic: 665 nm long pass, shortwave channel emission filter: 676/37 nm bandpass, longwave emission filter: 700/100 nm bandpass. An additional 405/488/561/640 nm quadnotch filter and 750 nm shortpass filter are common to the two paths and provide additional laser blocking). A compound cylindrical lens provides the astigmatism required for 3D imaging. To maintain a fixed focus across acquisitions exceeding 2 hours in time (comprising 200 000 – 250 000 images), focus locking is achieved by total internal reflection of a near-infrared fiber-coupled laser from the coverslip and subsequent height sensitive detection on a quadrant photodiode (QPD). The QPD signal provided closed-loop control of the objective lens piezo mount. For access to this microscope, refer to https://www.embl.org/about/info/imaging-centre or contact ic-contact@embl.de |
Single-mode fiber-coupled multi-laser engine | Toptica | iCHROME MLE-LFA-HP | Provides widefield epi-illumination of 100 mW at 405, 488, 561, 640 nm |
Splitting dichroic | AHF Analysentechnik | F48-665SG | 665 nm long pass |
Square cover glass 22 x 22 mm No.1 | Menzel-Gläser; VWR | 630-2882 | |
STAR 635P, NHS ester | Abberior | ST635P-0002-1MG | Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
Stereo microscope Stemi 305 Stand K LAB | Zeiss | N/A | |
Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich/Merck | T1512-2G | 1% (w/v) solution was prepared in Milli-Q water. Frozen aliquots were stored at -20 °C. Thawed aliquot was kept at 4 °C and used for several months. |
TetraSpeck Microspheres | ThermoFischer Scientific | T7279 | 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red |
Tris Saline Buffer (TBS 10x) | N/A | 200 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich/Merck | P9416-50ML | Kept at room temperature in original packaging. |
WormStuff worm pick | Kisker | 789277 | |
XY microscope stage | Smaract | N/A | Custom Design |
Zeba Micro Spin Desalting Column | ThermoFischer Scientific | 89877 | 7K MWCO, 75 µL |