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Abstract
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免疫与感染

Hypersensibilité de contact comme modèle murin de dermatite de contact allergique

Published: September 26, 2022
doi:
10.3791/64329
, , ,
1Department of Clinical Immunology,Wroclaw Medical University, 2Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences,Jagiellonian University Medical College, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences,Jagiellonian University Medical College

Summary

L’hypersensibilité de contact (SHC) est un modèle expérimental murin de dermatite de contact allergique (DCA). Le SHC est basé sur la sensibilisation à l’haptène réactif en peignant la peau rasée de la poitrine et de l’abdomen, avec un défi cutané ultérieur de l’oreille avec un haptène dilué, provoquant une réaction de gonflement qui est évaluée de diverses manières.

Abstract

L’hypersensibilité de contact (CHS) est un modèle expérimental de dermatite de contact allergique (DCA) qui peut être étudié chez la souris. Cette étude vise à présenter une méthode de laboratoire objective qui peut aider à étudier la réaction CHS chez la souris, qui peut être mesurée et quantifiée par divers tests. Pour induire le SHC, le jour « 0 », les souris ont été sensibilisées sur une tache précédemment rasée par peinture de la peau abdominale avec le 2,4,6-trinitrochlorobenzène (TNCB) haptène dans un mélange acétone-éthanol, tandis que les souris témoins négatives ont été sensibilisées avec un mélange véhicule seul-acétone-éthanol. Le jour « 4 », l’épaisseur de base de l’oreille a été mesurée avec un micromètre avant l’élicitation du SHC (défi) en peignant les deux oreilles avec de la TNCB diluée à la fois dans les groupes d’essai et témoin. Après 24 h, le gonflement de l’oreille a été mesuré avec un micromètre. Le SHC est un exemple de réponse immunitaire médiée par les lymphocytes T qui provoque un gonflement des tissus enflammés, culminant 24 heures après le défi cutané avec le même haptène. Une augmentation de l’œdème de l’oreille était corrélée à une augmentation du poids de l’oreille, à l’activité de la myéloperoxydase (MPO), à la concentration de cytokines pro-inflammatoires dans les extraits de l’oreille, à l’augmentation de l’épaississement du derme œdémateux lors de l’examen histologique et à la perméabilité vasculaire de l’oreille. Il y avait également une augmentation de la concentration d’anticorps IgG1 spécifiques du TNP dans le sérum du groupe test par rapport aux souris témoins. De plus, le SHC peut être transféré avec succès avec les cellules effectrices du SHC obtenues auprès de donneurs préalablement sensibilisés à la BNTN. Les cellules effectrices du SHC ont été administrées par voie intraveineuse à des souris receveuses naïves, qui ont ensuite été confrontées au même haptène dilué. L’enflure de l’oreille a été mesurée avec un micromètre 24 heures plus tard.

Introduction

La dermatite de contact allergique (DCA) est une maladie inflammatoire cutanée courante dans les pays industrialisés causée par une réaction d’hypersensibilité de type IV résultant de l’exposition à des produits chimiques de faible poids moléculaire appelés haptènes. Les substances qui provoquent la sensibilisation au contact chez l’homme comprennent les ions de métaux lourds (chrome, nickel, fer, cobalt), la térébenthine, les parfums, les colorants et les agents de conservation présents dans les cosmétiques (p. ex., p-phénylènediamine), certains médicaments (p. ex., néomycine, benzocaïne), les antibiotiques β-lactamine (p. ex., pénicilline), les produits chimiques produits par les plantes (pentadécacatéchol, une substance présente dans l’herbe à puce), ainsi que l’hydroquinone utilisée dans l’industrie photographique 1,2 . Les agents étiologiques ACD sont très élevés car plus de 100 000 produits chimiques sont utilisés dans l’industrie seulement, et 2 000 nouveaux sont synthétisés chaque année. À ce jour, plus de 3 700 molécules pouvant être des haptènes/allergènes de contact ont été identifiées3. La réaction d’hypersensibilité de contact (CHS) est un modèle expérimental de DCA qui peut être étudié chez la souris, les cobayes et les rats et peut être induit par l’application cutanée topique d’haptènes chimiques réactifs dissous dans des solvants organiques 4,5,6. Cette étude vise à décrire une méthode de laboratoire objective qui peut aider à étudier la réaction CHS chez la souris, qui peut être mesurée et quantifiée par divers tests.

Le SHC comprend des phases de sensibilisation (induction) et d’effecteur (défi). Dans les modèles animaux, les haptènes se lient d’abord de manière covalente aux protéines du corps pour créer des néoantigènes. Pendant la phase de sensibilisation, les kératinocytes activés favorisent la migration et la maturation des cellules dendritiques cutanées (SDC) en produisant des cytokines pro-inflammatoires-facteur de nécrose tumorale α (TNF-α) et de l’interleukine 1β (IL-1β)7. Les cellules de Langerhans épidermiques (LC) présentent des antigènes lors des phases d’induction et d’effecteurdu SHC 8. Les LC exposées à l’haptène pendant la sensibilisation favorisent l’induction des cellules régulatrices et effectrices9. De plus en plus de preuves provenant de plusieurs études suggèrent que les réponses au SHC peuvent être médiées par des cellules Th1 restreintes au CMH CD4+ de classe II, libérant localement de l’interféron γ (IFN-γ) pour utiliser un infiltrat inflammatoire caractéristique, des lymphocytes Tc1 restreints au CMH CD8+ de classe I qui peuvent également libérer des γ d’IFN, mais surtout médier les dommages cytotoxiques aux kératinocytes, et maintenant aussi des cellules Th17 productrices d’interleukine17 (IL-17) 10, 11.

Plusieurs modèles de SHC différents utilisant diverses espèces1 2,13,14 et haptènes ont été développés (une comparaison détaillée des différents haptènes, solvants et moments d’application est résumée dans le tableau 1). La souris, une espèce de laboratoire fréquemment utilisée, offre quelques avantages dans l’étude du SHC. Il y a plus de souches, de knockouts (KO) et d’animaux transgéniques chez les souris par rapport aux autres espèces, ce qui en fait un animal très attrayant15. De plus, le modèle CHS nécessite de nombreux animaux, et les souris sont plus économiques ici. Les modèles animaux n’imitent pas l’ACD dans tous les aspects; en particulier, ils présentent des croûtes et desquamations, ce qui n’est pas courant chez l’homme16,17. Les caractéristiques de la maladie chronique sont difficiles à reproduire, principalement parce que le modèle décrit ne suppose pas l’application de l’haptène pendant une longue période de temps. Cependant, il a été confirmé ici que de nombreux aspects importants de l’ACD sont reproduits. Il a également été démontré que, comme chez l’homme, ces caractéristiques sont associées à des réactions allergiques locales. Le choix de l’haptène, son solvant et son application décrits dans ce protocole ont été dictés par le fait que les résultats ont été confirmés par de nombreux tests in vitro et qu’il a été testé et modifié en laboratoire pendant de nombreuses années jusqu’à ce que la version actuelle soit établie. Les modèles murins permettent l’analyse des sous-ensembles cellulaires ou des cytokines qui sont impliqués dans le développement de la DCA et sont essentiels pour les évaluations précliniques de nouveaux traitements.

Protocol

Toutes les expériences présentées dans cet article ont été menées selon les directives du 1er Comité local d’éthique sur l’expérimentation animale à Cracovie. Toutes les procédures décrites ont été effectuées conformément aux recommandations locales, en particulier en ce qui concerne l’utilisation de la kétamine / xylazine comme anesthésique, l’utilisation des deux côtés des oreilles pour appliquer la substance / haptène, couper l’oreille et prélever le sang par l’ablation du globe ocula…

Representative Results

Pour l’induction du SHC, les animaux ont été sensibilisés par peinture cutanée (abdominale) avec 150 μL de TNCB à 5 % ou simulés sensibilisés avec le véhicule seul. Le jour « 4 », les réponses de gonflement de l’oreille des deux oreilles ont été induites par peinture de contact (défi) avec 10 μL de 0,4 % de TNCB chez les souris précédemment sensibilisées au TNCB (groupe test) et les souris du groupe témoin (simulacre sensibilisées). Les données présentées montrent que les souris sensi…

Discussion

Le SHC est induit par des haptènes, qui se lient aux antigènes auto-protéiques de la peau, créant des néoantigènes. Le SHC est médié par le recrutement extravasculaire local de lymphocytes T effecteurs CHS spécifiques de l’antigène circulant, ce qui entraîne un gonflement du tissu déficient, culminant 24 heures après l’exposition de la peau secondaire au même haptène6. Le gonflement du tissu est principalement causé par l’infiltration de leucocytes et le dépôt de f…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été soutenue par la subvention SUBZ. A020.22.060 de l’Université de médecine de Wroclaw, en Pologne, et par des subventions du ministère des Sciences et de l’Enseignement supérieur N N401 545940 à MS et IP2012 0443 72 à MMS.

Materials

70% ethanol Merck KGaA, Darmstadt, Germany 65350-M for surface disinfection
96-well flat-bottom plates, polypropylene Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria 655101 for MPO and Evans blue measurement – plates should be made of polypropylene, that has a lower binding capacity so proteins or DNA will not bind
Acetone (ACS reagent, ≥99.5%) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 179124
Aluminum foil Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z185140
Analytical balance Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, Germany PRACTUM224-1s, 29105177
Automated tissue processor MediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, India MTP-E-212 automatically prepare tissue samples by fixing, dehydrating, clearing, and infiltrating them with paraffin
BD Vacutainer SST II Advance (tube with gel for obtaining serum) Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USA BD 366882
Bicinchoninic acid kit for protein determination Merck KGaA, Darmstadt, Germany BCA1-1KT
Biotin Rat Anti-Mouse IgG1 Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 553441
BSA (bovine serum albumine) Merck KGaA, Darmstadt, Germany A9418 protein assays & analysis, 2 mg/mL
Cell strainer, pore size 70 μm BIOLOGIX, China 15-1070 suitable for 50 mL tubes
Coverslip VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 631-1583 24 mm, but it possible to use different size
Disposable pipettes capacity: 5 mL, 10 mL, 25 mL Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′s phosphate buffered saline) ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA 14190144 no calcium, no magnesium, mammalian cell culture
DPX Mountant for histology Merck KGaA, Darmstadt, Germany 6522 mounting media for H-E, might be used some other e.g, Canada balsam
Dumont 5 tweezers – straight Animalab, Poznan, Poland 11251-10FST surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Dumont 7 tweezers – bent Animalab, Poznan, Poland 11272-50FST surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Eosin Y solution, alcoholic Merck KGaA, Darmstadt, Germany HT110116
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL Eppenforf, Germany 3,01,20,086 polypropylene
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL Eppenforf, Germany 3,01,20,094 polypropylene, round bottom (the homogenization beads can easily move)
Ethanol 100% (absolute alkohol) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.07017
Ethanol 96% Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.59010
Evans blue Merck KGaA, Darmstadt, Germany E2129
FBS (fetal bovine serum) ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA A3160802
Formalin solution, neutral buffered, 10% Merck KGaA, Darmstadt, Germany HT501128
Formamide 99.5% (GC) Merck KGaA, Darmstadt, Germany F7503
Freezer -20 °C Bosch, Germany GSN54AW30
Fridge +4 °C / freezer -20 °C Bosch, Germany KGV36V10 mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL
Glass microskope slides, SuperFrost Plus VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449 Slides that eliminates the need to apply adhesive materials or protein coatings, to preventing any tissue sections loss during staining.
Graph Pad Prism GraphPad Software Inc. v. 9.4.0
Grey soap Pollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., Poland Bialy jelen soap bar grey Soap Bar Natural Hypoallergenic. Generally available product
H2SO4 (sulfuric acid) 1 mol/l (1 M) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.60313
Harris hematoxylin solution Merck KGaA, Darmstadt, Germany HHS16
Hemocytometer VWR, Avantor, U.S.A 612-5719 manual counting chamber is recommend, which is more accurate
Hexadecyltrimethylammonium bromide Merck KGaA, Darmstadt, Germany H5882
Homogenizer QIAGEN Hilden, Germany Tissue Lyser LT, SN 23.1001/05234 homogenizer with stainless steel beads (diameter 5 mm) for 2 mL centrifuge tubes
Horseradish peroxidase streptavidin (HRP streptavidin) Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA SA-5004-1
Hydrogen peroxide solution (H202) Merck KGaA, Darmstadt, Germany H1009
Incubator Heracell 150i Thermo Electron LED Gmbh, Germany 41071068 37 oC in the atmosphere of 5 % CO2, and 65 0C for deparaffinization the sections for histology
Ketamine 100 mg/mL, solution for injection Biowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Poland cat.# not avaliable
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) 99.995% anhydrous basis Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.05108
Laboratory Centrifuge Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, Germany B00013899 speed to 300 x g, with cooling to 4 0C
Laboratory Centrifuge Heraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germany 75002425 speed to 3,000 x g, with cooling to 4 0C
Mask (FFP2) VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 111-0917 for working with ortho-dianisine dihydrochloride
Mice Breeding unit of the Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, Krakow, Poland CBA/J, C57BL/6
Micrometer Mitutoyo, Tokyo, Japan 193-111 digit Outside Micrometer, Ratchet Stop, 0-25mm Range, 0.001mm Graduation, +/-0.002mm Accuracy, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml  
microplate, 96 well, microlon, high binding (for ELISA test) Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria 655061 with maxi-sorp binding surfaces for reliable and reproducible results in colormetric assays
Microscope with objectives Leica Microsystems CMS GmbH, Germany DM1000, 294011-082007 histology presented in the paper was performed under ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, with objectives: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD and FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD
Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard) Merck KGaA, Darmstadt, Germany M6908
Na2HPO4 x 7 H2O (sodium phosphate dibasic heptahydrate) Merck KGaA, Darmstadt, Germany S9390
Olive-oil Merck KGaA, Darmstadt, Germany 75343 pure, natural
OptEIA Mouse IFN-γ ELISA Set Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 555138
Ortho-dianisine dihydrochloride Merck KGaA, Darmstadt, Germany D3252
Paraffin wax Merck KGaA, Darmstadt, Germany 76242 beads, waxy solid
PBS (phosphate buffered saline) ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA 20012027 pH 7.2, mammalian cell culture
ph meter Elmetron, Poland CP-401
Pipettes, variable volume with tips Merck KGaA, Darmstadt, Germany EP3123000900-1EA 3-pack, Option 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, includes epT.I.P.S.
Razor blade VWR, Radnor, Pennsylvania, United States PERS94-0462 scraper and cutter blades, single edge, aluminium spine, 100 blades per box, individually wrapped
Rotary microtome MRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UK HIS-202A
Scissors – straight, sharp / sharp Animalab, Poznan, Poland 14060-10FST Surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Screw cap (open top) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 27056 black polypropylene hole cap, for use with 22 mL vial with 20-400 thread
Spectrophotometer BioTek Instruments, U.S.A 201446 universal microplate spectrophotometer: λ range: 200 – 999 nm, absorbance measurement range: 0.000 – 4.000 Abs
Staining dish 20 slides with rack Merck KGaA, Darmstadt, Germany S6141 e.g. 20 slide staining dishes complete with covers, slide rack and handle
Sterile Disposable Biopsy Punch 6mm Integra LifeSciences, Princeton, NJ, USA 33-36
Surgical scissors Animalab, Poznan, Poland 52138-46 surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Tissue processing cassettes Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z672122 tissue processing/ embedding cassettes with lid
TMB Substrate Reagent Set Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 555214
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzene) Tokyo Chemical Industry CO., LTD, Japan C0307
TNP-BSA (bovine serum albumin conjugated with 2,4,6-trinitrophenyl) Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USA T-5050
T-PER (tissue protein extration reagent) ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 78510
Tubes 15 mL sterile Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430055 (Corning) polypropylene, conical bottom
Tubes 50 mL, sterile Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430290 (Corning) polypropylene, conical bottom
Tween 20 Merck KGaA, Darmstadt, Germany P1379
Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mL Merck KGaA, Darmstadt, Germany 27173 for the preparation of hapten, screwed on so that it does not evaporate
Water bath AJL Electronic, Poland LW102
Wax (paraffin) dispenser VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 114-8737
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injection Vetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Poland cat.# not avaliable
Xylene (histological grade) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 534056
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Zemelka-Wiacek, M., Majewska-Szczepanik, M., Gajdanowicz, P., Szczepanik, M. Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. J. Vis. Exp. (187), e64329, doi:10.3791/64329 (2022).
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