Contactovergevoeligheid (CHS) is een muizenexperimenteel model van allergische contactdermatitis (ACD). CHS is gebaseerd op sensibilisatie met reactieve hapten door de geschoren huid van de borst en buik te schilderen, met een daaropvolgende oorhuiduitdaging met een verdunde hapten, waardoor een zwellingsreactie ontstaat die op verschillende manieren wordt beoordeeld.
Contactovergevoeligheid (CHS) is een experimenteel model van allergische contactdermatitis (ACD) dat kan worden bestudeerd bij muizen. Deze studie heeft tot doel een objectieve laboratoriummethode te presenteren die kan helpen bij het bestuderen van de CHS-reactie bij muizen, die kan worden gemeten en gekwantificeerd door verschillende tests. Om CHS te induceren, werden muizen op dag “0” op een eerder geschoren plek gesensibiliseerd door buikhuid te schilderen met het hapten 2,4,6-trinitrochlorobenzeen (TNCB) in een aceton-ethanolmengsel, terwijl negatieve controlemuizen werden gesensibiliseerd met een voertuig-aceton-ethanolmengsel. Op dag “4” werd de oordikte gemeten met een micrometer voorafgaand aan de elicitatie van CHS (challenge) door beide oren te schilderen met verdunde TNCB zowel in de test- als in de controlegroep. Na 24 uur werd de oorzwelling gemeten met een micrometer. CHS is een voorbeeld van een T-cel-gemedieerde immuunrespons die zwelling veroorzaakt in ontstoken weefsel, met een piek van 24 uur na de huiduitdaging met dezelfde hapten. Een toename van ooroedeem gecorreleerd met verhoogd oorgewicht, myeloperoxidase (MPO) activiteit, pro-inflammatoire cytokineconcentratie in de oorextracten, verhoogde verdikking van de oedemateuze dermis in het histologisch onderzoek en oor vasculaire permeabiliteit. Er was ook een toename van de concentratie van TNP-specifieke IgG1-antilichamen in de sera van de testgroep in vergelijking met de controlemuizen. Bovendien kan CHS met succes worden overgedragen met de CHS-effectorcellen die zijn verkregen van donoren die eerder zijn gesensibiliseerd met TNCB. De CHS-effectorcellen werden intraveneus toegediend aan naïeve ontvangende muizen, die vervolgens werden uitgedaagd met dezelfde verdunde hapten. Oorzwelling werd 24 uur later gemeten met een micrometer.
Allergische contactdermatitis (ACD) is een veel voorkomende huidontstekingsziekte in geïndustrialiseerde landen veroorzaakt door een type IV overgevoeligheidsreactie als gevolg van blootstelling aan chemicaliën met een laag molecuulgewicht die haptens worden genoemd. De stoffen die contactsensibilisatie bij de mens veroorzaken, zijn onder meer zware metaalionen (chroom, nikkel, ijzer, kobalt), terpentijn, geurstoffen, kleurstoffen en conserveermiddelen die aanwezig zijn in cosmetica (bijv. p-fenyleendiamine), sommige geneesmiddelen (bijv. neomycine, benzocaïne), β-lactamantibiotica (d.w.z. penicilline), chemicaliën geproduceerd door planten (pentadecacatechol, een stof die aanwezig is in poison ivy), evenals hydrochinon die wordt gebruikt in de fotografische industrie 1,2 . ACD-etiologische middelen zijn erg hoog, omdat alleen al in de industrie meer dan 100.000 chemicaliën worden gebruikt en elk jaar 2.000 nieuwe worden gesynthetiseerd. Tot op heden zijn meer dan 3.700 moleculen geïdentificeerd die contact haptens/allergenen kunnen zijn3. De contactovergevoeligheidsreactie (CHS) is een experimenteel model van ACD dat kan worden bestudeerd bij muizen, cavia’s en ratten en kan worden geïnduceerd door de plaatselijke huidtoepassing van reactieve chemische haptens opgelost in organische oplosmiddelen 4,5,6. Deze studie heeft tot doel een objectieve laboratoriummethode te beschrijven die kan helpen bij het bestuderen van de CHS-reactie bij muizen, die kan worden gemeten en gekwantificeerd door verschillende tests.
Het CHS bestaat uit sensibilisatie (inductie) en effector (challenge) fasen. In diermodellen binden haptens eerst covalent aan eiwitten in het lichaam om neoantigenen te creëren. Tijdens de sensibilisatiefase bevorderen geactiveerde keratinocyten de migratie en rijping van huiddendritische cellen (sDC’s) door pro-inflammatoire cytokines-tumornecrosefactor α (TNF-α) en interleukine 1β (IL-1β)7 te produceren. Epidermale Langerhans-cellen (LC’s) presenteren antigenen tijdens de CHS-inductie- en effectorfasen8. LCs blootgesteld aan hapten tijdens sensibilisatie bevorderen de inductie van zowel regulerende als effectorcellen9. Toenemend bewijs uit verschillende studies suggereert dat CHS-responsen kunnen worden gemedieerd door CD4 + MHC klasse II-beperkte Th1-cellen, waarbij lokaal interferon-γ (IFN-γ) vrijkomen om een karakteristiek ontstekingsinfiltraat te gebruiken, CD8 + MHC klasse I-beperkte Tc1-lymfocyten die ook IFN-γ kunnen afgeven, maar meestal cytotoxische schade aan keratinocyten kunnen bemiddelen, en nu ook interleukine 17 (IL-17) -producerende Th17-cellen10, 11.
Er zijn verschillende CHS-modellen ontwikkeld met verschillende soorten1 2,13,14 en haptens (een gedetailleerde vergelijking van verschillende haptens, oplosmiddelen en toedieningstijd is samengevat in tabel 1). De muis, een veelgebruikte laboratoriumsoort, biedt een paar voordelen bij het bestuderen van CHS. Er zijn meer stammen, knock-outs (KO) en transgene dieren onder muizen in vergelijking met andere soorten, waardoor ze een zeer aantrekkelijk dierzijn 15. Bovendien vereist het CHS-model veel dieren en zijn muizen hier zuiniger. Diermodellen bootsen ACD niet in alle opzichten na; in het bijzonder vertonen ze korstvorming en desquamatie, wat niet gebruikelijk is voor mensen 16,17. De kenmerken van chronische ziekten zijn een uitdaging om te reproduceren, vooral omdat het beschreven model niet uitgaat van de toepassing van de hapten voor een lange periode van tijd. Hier is echter bevestigd dat veel van de belangrijke aspecten van ACD worden gereproduceerd. Het is ook aangetoond dat, net als bij mensen, deze kenmerken geassocieerd zijn met lokale allergische reacties. De keuze van hapten, het oplosmiddel en de toepassing ervan die in dit protocol wordt beschreven, werden bepaald door het feit dat de resultaten zijn bevestigd door talrijke in vitro tests en dat het vele jaren in het laboratorium is getest en gewijzigd totdat de huidige versie werd vastgesteld. Muizenmodellen maken de analyse mogelijk van de celsubsets of cytokines die betrokken zijn bij de ontwikkeling van ACD en zijn essentieel voor preklinische beoordelingen van nieuwe behandelingen.
CHS wordt geïnduceerd via haptens, die zich binden aan zelfeiwitantigenen in de huid, waardoor neoantigenen ontstaan. CHS wordt gemedieerd door lokale extravasculaire rekrutering van circulerende antigeenspecifieke CHS-effector T-cellen, wat resulteert in zwelling in het uitgedaagde weefsel, met een piek van 24 uur na blootstelling van de secundaire huid aan dezelfde hapten6. De zwelling van het weefsel wordt voornamelijk veroorzaakt door de infiltratie van leukocyten en leukocytenafhank…
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd ondersteund door subsidiëring SUBZ. A020.22.060 van de Medische Universiteit in Wroclaw, Polen, en door subsidies van het ministerie van Wetenschap en Hoger Onderwijs N N401 545940 aan MS en IP2012 0443 72 aan MMS.
70% ethanol | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 65350-M | for surface disinfection |
96-well flat-bottom plates, polypropylene | Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria | 655101 | for MPO and Evans blue measurement – plates should be made of polypropylene, that has a lower binding capacity so proteins or DNA will not bind |
Acetone (ACS reagent, ≥99.5%) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 179124 | |
Aluminum foil | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | Z185140 | |
Analytical balance | Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, Germany | PRACTUM224-1s, 29105177 | |
Automated tissue processor | MediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, India | MTP-E-212 | automatically prepare tissue samples by fixing, dehydrating, clearing, and infiltrating them with paraffin |
BD Vacutainer SST II Advance (tube with gel for obtaining serum) | Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USA | BD 366882 | |
Bicinchoninic acid kit for protein determination | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | BCA1-1KT | |
Biotin Rat Anti-Mouse IgG1 | Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA | 553441 | |
BSA (bovine serum albumine) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | A9418 | protein assays & analysis, 2 mg/mL |
Cell strainer, pore size 70 μm | BIOLOGIX, China | 15-1070 | suitable for 50 mL tubes |
Coverslip | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 631-1583 | 24 mm, but it possible to use different size |
Disposable pipettes capacity: 5 mL, 10 mL, 25 mL | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | Z740301, Z740302, Z740303 | |
DPBS (Dulbecco′s phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14190144 | no calcium, no magnesium, mammalian cell culture |
DPX Mountant for histology | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 6522 | mounting media for H-E, might be used some other e.g, Canada balsam |
Dumont 5 tweezers – straight | Animalab, Poznan, Poland | 11251-10FST | surgical instruments for procedures on mice (should be steriled) |
Dumont 7 tweezers – bent | Animalab, Poznan, Poland | 11272-50FST | surgical instruments for procedures on mice (should be steriled) |
Eosin Y solution, alcoholic | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | HT110116 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppenforf, Germany | 3,01,20,086 | polypropylene |
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL | Eppenforf, Germany | 3,01,20,094 | polypropylene, round bottom (the homogenization beads can easily move) |
Ethanol 100% (absolute alkohol) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.07017 | |
Ethanol 96% | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.59010 | |
Evans blue | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | E2129 | |
FBS (fetal bovine serum) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A3160802 | |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | HT501128 | |
Formamide 99.5% (GC) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | F7503 | |
Freezer -20 °C | Bosch, Germany | GSN54AW30 | |
Fridge +4 °C / freezer -20 °C | Bosch, Germany | KGV36V10 | mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL |
Glass microskope slides, SuperFrost Plus | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449 | Slides that eliminates the need to apply adhesive materials or protein coatings, to preventing any tissue sections loss during staining. |
Graph Pad Prism | GraphPad Software Inc. | v. 9.4.0 | |
Grey soap | Pollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., Poland | Bialy jelen soap bar | grey Soap Bar Natural Hypoallergenic. Generally available product |
H2SO4 (sulfuric acid) 1 mol/l (1 M) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.60313 | |
Harris hematoxylin solution | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | HHS16 | |
Hemocytometer | VWR, Avantor, U.S.A | 612-5719 | manual counting chamber is recommend, which is more accurate |
Hexadecyltrimethylammonium bromide | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | H5882 | |
Homogenizer | QIAGEN Hilden, Germany | Tissue Lyser LT, SN 23.1001/05234 | homogenizer with stainless steel beads (diameter 5 mm) for 2 mL centrifuge tubes |
Horseradish peroxidase streptavidin (HRP streptavidin) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA | SA-5004-1 | |
Hydrogen peroxide solution (H202) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | H1009 | |
Incubator Heracell 150i | Thermo Electron LED Gmbh, Germany | 41071068 | 37 oC in the atmosphere of 5 % CO2, and 65 0C for deparaffinization the sections for histology |
Ketamine 100 mg/mL, solution for injection | Biowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Poland | cat.# not avaliable | |
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) 99.995% anhydrous basis | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.05108 | |
Laboratory Centrifuge | Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, Germany | B00013899 | speed to 300 x g, with cooling to 4 0C |
Laboratory Centrifuge | Heraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germany | 75002425 | speed to 3,000 x g, with cooling to 4 0C |
Mask (FFP2) | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 111-0917 | for working with ortho-dianisine dihydrochloride |
Mice | Breeding unit of the Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, Krakow, Poland | CBA/J, C57BL/6 | |
Micrometer | Mitutoyo, Tokyo, Japan | 193-111 | digit Outside Micrometer, Ratchet Stop, 0-25mm Range, 0.001mm Graduation, +/-0.002mm Accuracy, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml |
microplate, 96 well, microlon, high binding (for ELISA test) | Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria | 655061 | with maxi-sorp binding surfaces for reliable and reproducible results in colormetric assays |
Microscope with objectives | Leica Microsystems CMS GmbH, Germany | DM1000, 294011-082007 | histology presented in the paper was performed under ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, with objectives: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD and FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD |
Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | M6908 | |
Na2HPO4 x 7 H2O (sodium phosphate dibasic heptahydrate) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | S9390 | |
Olive-oil | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 75343 | pure, natural |
OptEIA Mouse IFN-γ ELISA Set | Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA | 555138 | |
Ortho-dianisine dihydrochloride | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | D3252 | |
Paraffin wax | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 76242 | beads, waxy solid |
PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 20012027 | pH 7.2, mammalian cell culture |
ph meter | Elmetron, Poland | CP-401 | |
Pipettes, variable volume with tips | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | EP3123000900-1EA | 3-pack, Option 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, includes epT.I.P.S. |
Razor blade | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | PERS94-0462 | scraper and cutter blades, single edge, aluminium spine, 100 blades per box, individually wrapped |
Rotary microtome | MRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UK | HIS-202A | |
Scissors – straight, sharp / sharp | Animalab, Poznan, Poland | 14060-10FST | Surgical instruments for procedures on mice (should be steriled) |
Screw cap (open top) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 27056 | black polypropylene hole cap, for use with 22 mL vial with 20-400 thread |
Spectrophotometer | BioTek Instruments, U.S.A | 201446 | universal microplate spectrophotometer: λ range: 200 – 999 nm, absorbance measurement range: 0.000 – 4.000 Abs |
Staining dish 20 slides with rack | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | S6141 | e.g. 20 slide staining dishes complete with covers, slide rack and handle |
Sterile Disposable Biopsy Punch 6mm | Integra LifeSciences, Princeton, NJ, USA | 33-36 | |
Surgical scissors | Animalab, Poznan, Poland | 52138-46 | surgical instruments for procedures on mice (should be steriled) |
Tissue processing cassettes | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | Z672122 | tissue processing/ embedding cassettes with lid |
TMB Substrate Reagent Set | Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | |
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzene) | Tokyo Chemical Industry CO., LTD, Japan | C0307 | |
TNP-BSA (bovine serum albumin conjugated with 2,4,6-trinitrophenyl) | Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USA | T-5050 | |
T-PER (tissue protein extration reagent) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 78510 | |
Tubes 15 mL sterile | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | CLS430055 (Corning) | polypropylene, conical bottom |
Tubes 50 mL, sterile | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | CLS430290 (Corning) | polypropylene, conical bottom |
Tween 20 | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | P1379 | |
Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mL | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 27173 | for the preparation of hapten, screwed on so that it does not evaporate |
Water bath | AJL Electronic, Poland | LW102 | |
Wax (paraffin) dispenser | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 114-8737 | |
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injection | Vetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Poland | cat.# not avaliable | |
Xylene (histological grade) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 534056 |