İnsan Mikroglia Benzeri Hücreler: İnsan Sinaptozomları Kullanılarak İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden ve In Vitro Canlı Hücre Fagositoz Analizinden Farklılaşma
Summary
Bu protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (iPSC’ler) in vitro deney için mikroglia benzeri hücrelere farklılaşma sürecini açıklar. Ayrıca, canlı hücre görüntüleme sistemlerini kullanarak in vitro fagositoz testleri için bir substrat olarak kullanılabilecek iPSC kaynaklı alt motor nöronlardan insan sinaptozomları üretmek için ayrıntılı bir prosedür de sunuyoruz.
Abstract
Mikroglia, beyin mikro ortamında homeostazı koruyan ve çoklu nörolojik hastalıklarda kilit bir oyuncu haline gelen miyeloid kökenli yerleşik bağışıklık hücreleridir. İnsan mikrogliasını sağlık ve hastalıkta incelemek, insan hücrelerinin son derece sınırlı arzı nedeniyle bir meydan okumayı temsil eder. İnsan bireylerden türetilen indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC’ler) bu bariyeri aşmak için kullanılabilir. Burada, in vitro deneyler için insan iPSC’lerinin mikroglia benzeri hücrelere (iMG’ler) nasıl ayırt edileceği gösterilmiştir. Bu iMG’ler, mikroglia benzeri morfoloji, uygun belirteçlerin ekspresyonu ve aktif fagositoz dahil olmak üzere mikroglia’nın beklenen ve fizyolojik özelliklerini sergiler. Ek olarak, insan iPSC kaynaklı alt motor nöronlardan (i3LMN’ler) türetilen sinaptozom substratlarının izole edilmesi ve etiketlenmesi için belgeler sağlanmaktadır. Canlı hücreli, uzunlamasına bir görüntüleme testi, pH’a duyarlı bir boya ile etiketlenmiş insan sinaptozomlarının yutulmasını izlemek için kullanılır ve iMG’nin fagositik kapasitesinin araştırılmasına izin verir. Burada açıklanan protokoller, insan mikroglia biyolojisini ve mikroglia’nın hastalığa katkısını araştıran farklı alanlara geniş ölçüde uygulanabilir.
Introduction
Mikroglia, merkezi sinir sistemindeki (CNS) yerleşik bağışıklık hücreleridir ve CNS’nin geliştirilmesinde çok önemli bir rol oynar. Mikroglia, yetişkin beyninde homeostazı korumak ve travma ve hastalık süreçlerine aktif olarak yanıt vermek için de önemlidir. Kümülatif kanıtlar, mikroglia’nın çoklu nörogelişimsel ve nörodejeneratif hastalıkların patogenezinde anahtar katkıda bulunduğunu göstermektedir 1,2. Mikroglial biyoloji hakkındaki mevcut bilgiler ağırlıklı olarak fare modellerinden türetilmiş olsa da, son çalışmalar murin ve insan mikrogliası arasındaki önemli farklılıkları aydınlatmış ve insan mikrogliasının genetiğini ve biyolojik işlevlerini incelemek için teknolojilerin geliştirilmesine duyulan ihtiyacı vurgulamıştır 3,4. Mikroglia’nın disseke edilmiş birincil dokudan izole edilmesi, mikroglia özelliklerini ciddi şekilde değiştirebilir5, bu tür hücrelerle elde edilen potansiyel olarak kafa karıştırıcı sonuçlar. Bu yöntemin genel amacı, insan iPSC’lerini iMG’lere ayırt etmek, böylece bazal koşullar altında insan mikrogliasını incelemek için bir hücre kültürü sistemi sağlamaktır. Ayrıca, tamamen insan model sistemi kullanan bir fagositoz testi, hem kalite kontrol önlemi olarak hem de hastalık bağlamında iMG disfonksiyonunu değerlendirmek için iMG’lerin işlevselliğini incelemek için bir araç olarak buraya dahil edilmiştir.
Mikroglia’nın iPSC’lerden farklılaşması için çoklu protokoller son zamanlarda literatürdeortaya çıkmıştır 6,7,8,9,10. Bazı protokollerin potansiyel dezavantajları arasında uzun veya uzun süreli farklılaşma, çoklu büyüme faktörlerinin eklenmesi ve / veya karmaşık deneysel prosedürler 6,9,10 bulunmaktadır. Burada, iPSC’lerin ilkel makrofaj öncülleri (PMP’ler) olarak adlandırılan öncü hücrelere farklılaştırılması yoluyla mikroglia ontojenisinin yönlerini özetleyen “kullanıcı dostu” bir farklılaşma yöntemi gösterilmiştir7,11. PMP’ler daha önce açıklandığı gibi oluşturulur ve bazı optimizasyonlar burada12’de sunulmuştur. PMP’ler, kan-beyin bariyeri kapanmadan önce beyni istila ederek embriyonik gelişim sırasında mikrogliaya yol açan MYB’den bağımsız yumurta sarısı kesesi kaynaklı makrofajları taklit eder13. PMP’leri iMG’lere ölümcül bir şekilde ayırt etmek için, Haenseler ve ark. ve Brownjohn ve ark. tarafından protokollere dayanan hızlı ve basitleştirilmiş bir monokültür yöntemi kullandık ve iMG’lerin mikroglia ile zenginleştirilmiş belirteçleri 7,8 sağlam bir şekilde eksprese ettiği verimli bir mikroglia farklılaşma yöntemi oluşturmak için bazı değişiklikler yaptık. Bu farklılaştırma yöntemi, iPSC’lerin kültüründe uzmanlığa sahip laboratuvarlarda ve bir insan modeli sistemi kullanarak mikroglia biyolojisini incelemeyi amaçlayan araştırma hedefleriyle çoğaltılabilir.
iPSC türevi mikroglia, in vitro deneyler için biyolojik olarak ilgili bir insan mikroglia kaynağını temsil eder ve fagositoz da dahil olmak üzere mikroglial kanonik fonksiyonları araştırmak için önemli bir araçtır. Mikroglia, hücre kalıntılarını, toplanmış proteinleri ve bozulmuş miyelin14’ü temizledikleri beyin ve CNS’nin profesyonel fagositleridir. Mikroglia ayrıca sinapsları yutarak sinaptik yeniden şekillenmede ve patojenlerin fagositozu yoluyla dış enfeksiyonlara karşı savunmada işlev görür15,16. Bu protokolde, iMG’ler tarafından fagositoz, iMG yutulması için materyal olarak insan sinaptozomları kullanılarak değerlendirilir. Bu amaçla, insan i3LMN’lerinden türetilen sinaptozomları izole etmek için bir açıklama açıklanmaktadır. i3LMN türevi insan sinaptozomları, fagozom işleme ve in vitro bozunma sırasında asidik bölmeler içinde lokalize sinaptozomların miktarının belirlenmesine izin veren pH’a duyarlı bir boya ile etiketlenmiştir. Canlı hücre mikroskobu kullanan bir fagositoz testi, mikroglia yutulmasının dinamik sürecini gerçek zamanlı olarak izlemek için gösterilmiştir. Bu fonksiyonel tahlil, tam bir insan sistemi kullanarak sağlık ve hastalıkta mikroglial fagositozdaki olası kusurları araştırmak için bir temel oluşturur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan farklılaşma protokolü, iPSC türevli mikroglia benzeri hücreleri ~ 6-8 hafta içinde yüksek saflıkta ve immünofloresan deneyleri ve daha fazla sayıda hücre gerektiren diğer tahlilleri gerçekleştirmek için yeterli verimde elde etmek için etkili bir yöntem sağlar. Bu protokol, 1 haftada 1 × 106 iMG’ye kadar verim vermiştir, bu da protein ve RNA ekstraksiyonuna ve karşılık gelen aşağı akış analizlerine (örneğin, RNASeq, qRT-PCR, batı lekesi, kütle spektrometrisi) i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, motor nöron farklılaşması için WTC11 hNIL iPSC hattını sağladığı için Michael Ward’a ve mikroglia farklılaşması için kullanılan KOLF2.1J WT klonu B03 iPSC hattını tedarik ettiği için Jackson Laboratuvarlarına teşekkür eder. Ayrıca, protokollerin uygulanması sırasındaki desteği için Dorothy Schafer’e, canlı hücre görüntüleme sistemine yardımları için Anthony Giampetruzzi ve John Landers’a, revizyonlar sırasındaki teknik katkıları için Hayden Gadd’e ve bu çalışmadaki işbirliği için Jonathan Jung’a teşekkür ederiz. Bu çalışma, UMASS Chan Tıp Fakültesi’nden Dan ve Diane Riccio Sinirbilim Fonu ve Angel Fund, Inc. tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Antibodies for immunofluorescence analysis | |||
| anti-IBA1 rabbit antibody | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 dilution |
| anti-P2RY12 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 dilution |
| anti-TMEM119 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 dilution |
| Antibodies for Western blot analysis | |||
| anti-β-Tubulin rabbit antibody | Abcam | ab6046 | 1:500 dilution |
| anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody | Abclonal | A6344 | 1:1,000 dilution |
| anti-PSD95 mouse antibody | Millipore | MAB1596 | 1:500 dilution |
| Borate buffer components | |||
| Boric acid (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium chloride (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Sodium tetraborate (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Cell culture materials | |||
| 6-well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm Cell Strainers | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated | CELLTREAT | 229620 | |
| Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile | CELLTREAT | 229305 | |
| low adherence round-bottom 96-well plate | Corning | 7007 | |
| Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353847, | |
| Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
| Cell dissociation reagents | |||
| Accutase | Corning | 25058CI | dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation |
| TrypLE reagent | Life Technologies | 12-605-010 | dissociation reagents used for microglia differentiation |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Coating reagents for cell culture | |||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning™ | 354230 | Referred as to extracellular matrix coating reagent |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Referred as to laminin 521 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer |
| Components of iPSC media | |||
| mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | To prepare iPSC media mixed the components to 1x |
| Components of EB media | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | final concentration 50 ng/mL |
| iPSC media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | final concentration 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | final concentration 50 ng/mL |
| Components of PMP base media | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | final concentration 1x |
| Components of PMP complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | final concentration 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 100 ng/mL |
| PMP base media | final concentration 1x | ||
| Components of iMG base media | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| Components of iMG complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-34 | PeproTech or Biologend | 200-34 or 577904 | final concentration 100 ng/mL |
| iMG base media | final concentration 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | final concentration 50 ng/mL |
| Components of Induction base media | |||
| DMEM/F12 with HEPES | Gibco | 11330032 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| Components of Complete induction media | |||
| Compound E | Calbiochem | 565790 | final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS |
| Induction base media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 μM |
| Components of Neuron media | |||
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | final concentration 1x for media and suplemment |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| iPSC lines used in this study | |||
| KOLF2.1J: WT clone B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Synaptosome isolation reagents | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 87793 | Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes |
| Phagocytosis assay dyes | |||
| NucBlue Live Ready reagent | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Red, succinimidyl ester | ThermoFisher Scientific | P36600 | Referred as to pH-sensitive dye |
| Other cell-culture reagents | |||
| Trypan Blue, 0.4% Solution | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Reconstitute to 40 mM in sterile water |
| Cytochalasin D | Sigma | final concentration 10 µM | |
| DPBS with Calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | Referred as to DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017015 | Referred as to laminin |
| Software and Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytation 5 live cell imaging reader | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | version 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | refer as tube shaker | |
| Water sonicator | Elma | Mode Transsonic 310 |
References
- Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254 (2021).
- Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065 (2021).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
- Brownjohn, P. W., et al. Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia. Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).
- Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
- McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
- Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
- Haenseler, W., Rajendran, L. Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia. Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).
- Wilgenburg, B. v., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PloS One. 8 (8), 71098 (2013).
- Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of tissue-resident macrophages. Frontiers in Immunology. 6, 486 (2015).
- Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson’s disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144 (2018).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545 (2015).
- Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138 (2014).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
- Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808 (2020).
- Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
- Schmidt, E. J., et al. ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
