תאים דמויי מיקרוגליה אנושית: התמיינות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ובדיקת פאגוציטוזה של תאים חיים במבחנה באמצעות סינפטוזומים אנושיים

מיקרוגליה הם תאי מערכת החיסון המתגוררים במערכת העצבים המרכזית (CNS) וממלאים תפקיד מכריע בהתפתחות מערכת העצבים המרכזית. מיקרוגליה חשובה גם במוח הבוגר לשמירה על הומאוסטזיס ולתגובה פעילה לתהליכי טראומה ומחלות. ראיות מצטברות מראות כי מיקרוגליה הם תורמים מרכזיים לפתוגנזה של מחלות נוירו-התפתחותיות ונוירודגנרטיביות מרובות ^1,2. אף על פי שהידע הנוכחי על ביולוגיה של מיקרוגליה נגזר בעיקר ממודלים של עכברים, מחקרים אחרונים הבהירו הבדלים חשובים בין מורין למיקרוגליה אנושית, והדגישו את הצורך בפיתוח טכנולוגיות לחקר הגנטיקה והתפקודים הביולוגיים של המיקרוגליה האנושית ^3,4. בידוד של מיקרוגליה מרקמה ראשונית מנותקת יכול לשנות באופן חמור את תכונות המיקרוגליה⁵, מה שעלול לבלבל תוצאות שנרכשו עם תאים כאלה. המטרה הכוללת של שיטה זו היא להבדיל תאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) אנושיים ל-iMGs, ובכך לספק מערכת תרבית תאים לחקר מיקרוגליה אנושית בתנאים בסיסיים. יתר על כן, בדיקת פאגוציטוזה באמצעות מערכת מודל אנושית מלאה נכללת כאן כאמצעי לחקור את הפונקציונליות של iMGs, הן כמדד בקרת איכות והן כדי להעריך תפקוד לקוי של iMG בהקשר של מחלה.

פרוטוקולים מרובים להתמיינות מיקרוגליה מ- iPSCs הופיעו לאחרונה בספרות 6,7,8,9,10. חסרונות פוטנציאליים של פרוטוקולים מסוימים כוללים תקופות ממושכות או ארוכות של הבחנה, תוספת של גורמי גדילה מרובים ו / או הליכים ניסיוניים מורכבים ^6,9,10. כאן מודגמת שיטת התמיינות “ידידותית למשתמש”, המשחזרת היבטים של מיקרוגליה אונטוגנית באמצעות התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים לתאים מקדימים המכונים מבשרי מקרופאגים פרימיטיביים (PMPs)^7,11. PMPs נוצרים כפי שתואר קודם לכן, עם כמה אופטימיזציות המוצגות כאן¹². ה-PMPs מחקים מקרופאגים שמקורם בחלמון שאינו תלוי בחלמון, אשר מולידים מיקרוגליה במהלך ההתפתחות העוברית על ידי פלישה למוח לפני סגירת מחסום הדם-מוח¹³. כדי להבדיל באופן סופי בין PMPs ל-iMGs, השתמשנו בשיטת מונוקולטורה מהירה ופשוטה המבוססת על פרוטוקולים של Haenseler et al. ו-Brownjohn et al., עם כמה שינויים כדי ליצור שיטת בידול יעילה של מיקרוגליה, שבה iMGs מבטאים בחוזקה סמנים מועשרים במיקרוגליה ^7,8. ניתן לשכפל שיטת בידול זו במעבדות עם מומחיות בתרבית של iPSCs ועם מטרות מחקר שמטרתן לחקור את הביולוגיה של מיקרוגליה באמצעות מערכת מודל אנושית.

מיקרוגליה שמקורה ב-iPSC מהווה מקור רלוונטי ביולוגית של מיקרוגליה אנושית לניסויים במבחנה, והם כלי חשוב לחקר תפקודים קנוניים של מיקרוגליה, כולל פאגוציטוזה. מיקרוגליה הם הפאגוציטים המקצועיים של המוח ושל מערכת העצבים המרכזית, שם הם מנקים פסולת תאים, חלבונים מצטברים ומיאלין¹⁴ פגום. מיקרוגליה מתפקדת גם בשיפוץ סינפטי על ידי בליעת סינפסות ובהגנה מפני זיהומים חיצוניים באמצעות פאגוציטוזה של פתוגנים^15,16. בפרוטוקול זה, פאגוציטוזה על ידי iMGs מוערכת באמצעות סינפטוזומים אנושיים כחומר לבליעת iMG. לשם כך מתואר תיאור לבידוד סינפטוזומים הנגזרים מ-i³LMNs אנושיים. הסינפטוזומים האנושיים שמקורם ב-i³LMN מסומנים בצבע רגיש ל-pH המאפשר כימות של סינפטוזומים הממוקמים בתוך מדורים חומציים במהלך עיבוד פגוזומים והשפלה במבחנה. בדיקת פאגוציטוזה באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים מוצגת לניטור התהליך הדינמי של בליעת מיקרוגליה בזמן אמת. בדיקה תפקודית זו קובעת בסיס לחקור פגמים אפשריים בפאגוציטוזה מיקרוגליאלית בבריאות ובמחלות באמצעות מערכת אנושית שלמה.