Humane microglia-achtige cellen: differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen en in vitro live-cel fagocytosetest met behulp van humane synaptosomen

Microglia zijn de residente immuuncellen in het centrale zenuwstelsel (CZS) en spelen een cruciale rol bij de ontwikkeling van het CZS. Microglia zijn ook belangrijk in de volwassen hersenen voor het handhaven van homeostase en het actief reageren op trauma- en ziekteprocessen. Cumulatief bewijs toont aan dat microglia een belangrijke bijdrage leveren aan de pathogenese van meerdere neurologische en neurodegeneratieve ziekten ^1,2. Hoewel de huidige kennis over microgliale biologie voornamelijk is afgeleid van muismodellen, hebben recente studies belangrijke verschillen tussen muizen- en menselijke microglia opgehelderd, wat de noodzaak onderstreept van het ontwikkelen van technologieën om de genetica en biologische functies van menselijke microglia te bestuderen ^3,4. Isolatie van microglia uit ontleed primair weefsel kan microglia-eigenschappen ernstig wijzigen⁵, waardoor de resultaten die met dergelijke cellen worden verkregen, mogelijk worden verstoord. Het algemene doel van deze methode is om menselijke iPSC’s te differentiëren in iMG’s, waardoor een celkweeksysteem wordt geboden om menselijke microglia onder basale omstandigheden te bestuderen. Bovendien is een fagocytosetest met behulp van een volledig menselijk modelsysteem hierin opgenomen als een middel om de functionaliteit van iMG’s te bestuderen, zowel als een kwaliteitscontrolemaatstaf als om iMG-disfunctie in de context van ziekte te beoordelen.

Meerdere protocollen voor microglia differentiatie van iPSC’s zijn onlangs in de literatuur naar voren gekomen ^6,7,8,9,10. Mogelijke nadelen van sommige protocollen zijn langere of lange perioden van differentiatie, de toevoeging van meerdere groeifactoren en/of complexe experimentele procedures ^6,9,10. Hier wordt een “gebruiksvriendelijke” differentiatiemethode aangetoond die aspecten van microglia-ontogenie recapituuleert door differentiatie van iPSC’s in voorlopercellen die primitieve macrofaagprecursoren (PMP’s) worden genoemd)^7,11. PMP’s worden gegenereerd zoals eerder beschreven, met enkele optimalisaties hierin gepresenteerd¹². De PMP’s bootsen MYB-onafhankelijke dooier-zak-afgeleide macrofagen na, die tijdens de embryonale ontwikkeling microglia veroorzaken door de hersenen binnen te dringen vóór de sluiting van de bloed-hersenbarrière¹³. Om PMP’s terminaal te differentiëren in iMG’s, gebruikten we een snelle en vereenvoudigde monocultuurmethode op basis van protocollen van Haenseler et al. en Brownjohn et al., met enkele aanpassingen om een efficiënte microgliadifferentiatiemethode te genereren waarin iMG’s robuust microglia-verrijkte markers tot expressie brengen ^7,8. Deze differentiatiemethode kan worden gereproduceerd in laboratoria met expertise in de cultuur van iPSC’s en met onderzoeksdoelen gericht op het bestuderen van microgliabiologie met behulp van een menselijk modelsysteem.

iPSC-afgeleide microglia vormen een biologisch relevante bron van menselijke microglia voor in vitro experimenten en zijn een belangrijk hulpmiddel om microgliale canonieke functies, waaronder fagocytose, te onderzoeken. Microglia zijn de professionele fagocyten van de hersenen en het CZS, waar ze celresten, geaggregeerde eiwitten en afgebroken myeline^{opruimen 14}. Microglia functioneren ook bij synaptische remodellering door synapsen te overspoelen en in de verdediging tegen externe infecties door fagocytose van pathogenen ^15,16. In dit protocol wordt fagocytose door iMG’s beoordeeld met behulp van menselijke synaptosomen als materiaal voor iMG-overspoeling. Hiertoe wordt een beschrijving beschreven voor het isoleren van synaptosomen afgeleid van humane i^{3 LMN’s}. De i³LMN-afgeleide humane synaptosomen zijn gelabeld met een pH-gevoelige kleurstof die kwantificering mogelijk maakt van synaptosomen gelokaliseerd in zure compartimenten tijdens fagosoomverwerking en afbraak in vitro. Een fagocytosetest met behulp van live-cell microscopie wordt getoond voor het monitoren van het dynamische proces van microglia-engulfment in realtime. Deze functionele test legt een basis om mogelijke defecten in microgliale fagocytose in gezondheid en ziekte te onderzoeken met behulp van een compleet menselijk systeem.