형광 크기 배제 크로마토그래피를 통한 멤브레인 단백질 품질의 신속한 평가

1. FSEC용 세제 및 완충제 준비 세제 원액을 준비하십시오.20mL 원액을 준비하기 위해 도데실 말토사이드(DDM) 분말 4g과 콜레스테릴 헤미숙시네이트(CHS) 분말 0.4g을 칭량하여 실험실 등급 증류H2O로 20mL로 만듭니다. 모든 성분을 첨가한 후, 성분이 완전히 용해될 때까지 4°C에서 종단 반전으로 혼합합니다. 4 °C에서 하룻밤 동안 혼합하는 것이 좋습니다. 사용할 때까지 세제 스톡을 -20°C에서 분취하여 보관하십시오. 육수를 즉시 사용해야 하는 경우 세제를 얼음에 보관하십시오.알림: 이 작업에 사용된 표준 세제 스톡은 20%(w/v) DDM 및 2%(w/v) CHS 혼합물이었습니다( 재료 표 참조). 상이한 세제(예를 들어, 라우릴 말토스 네오펜틸 글리콜; LMNG) 또는 스티렌-말레산(SMA)과 같은 폴리머를 사용한 세제 없는 추출의 사용을 테스트할 수 있습니다. 이것은 테스트할 실험 조건을 설계할 때 결정되어야 합니다. 가용화 완충액을 준비한다.비커에서 100mM HEPES, 200mM NaCl, 20%(v/v) 글리세롤 및 1x 프로테아제 억제제 칵테일( 재료 표 참조)의 최종 농도를 달성하기 위해 성분의 정확한 중량 또는 부피를 조합하여 가용화 완충액을 준비합니다.참고: 본 연구에서, 50 mL의 가용화 완충액의 제조는 5개의 샘플을 처리하기에 충분하였다. 0.7 부피 (예를 들어, 50 mL의 완충액을 만드는 경우 35 mL)의 실험실 등급 증류된H2O를 비커에 첨가한다. 마그네틱 교반기 상에서 혼합하고, pH 미터를 이용하여, 농축 NaOH를 적가하여 완충액 pH를 7.5로 조정한다. 측정 실린더를 사용하여 실험실 등급의 증류된H2O로 완충액을 최종적으로 필요한 부피까지 보충합니다. SEC 실행 버퍼를 준비합니다.비커에서 100mM HEPES, 150mM NaCl 및 10%(v/v) 글리세롤의 최종 농도를 달성하기 위해 구성 요소의 정확한 중량 또는 부피를 결합하여 SEC 실행 버퍼를 준비합니다.참고: 본 연구에서는 600mL의 SEC 버퍼를 준비하는 것만으로도 5개의 샘플을 실행하기에 충분했습니다. 0.7 부피(예를 들어, 600 mL의 완충액을 만드는 경우 420 mL)의 실험실 등급 증류된H2O를 비커에 첨가한다. 마그네틱 교반기 상에서 혼합하고, pH 미터를 이용하여, 농축 NaOH를 적가하여 완충액 pH를 7.5로 조정한다. 측정 실린더를 사용하여 실험실 등급의 증류된H2O로 완충액을 최종적으로 필요한 부피까지 보충합니다. 진공 상태에서 병 상단 0.45μm 공극 필터를 통해 SEC 버퍼를 필터링합니다( 재료 표 참조). 버퍼가 필터를 통과하면 흔들 때 더 이상 기포가 나타나지 않을 때까지 진공 상태로 두어 가스를 제거합니다. 0.03단계에서 준비한 세제 스톡의 필요한 부피를 추가하여 0.003%(w/v) DDM 및 0.003%(w/v) CHS의 최종 농도를 SEC 버퍼에 추가합니다(예: 0.9mL의 SEC 버퍼를 만드는 경우 600mL). 사용하기 전에 버퍼를 미리 식히십시오.참고: 테스트한 조건에 따라 다른 버퍼를 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 관심 단백질에 대한 다른 세제의 효과를 테스트하는 경우 단백질을 가용화하는 데 사용되는 것과 동일한 세제를 사용하는 완충액을 만드는 것이 이상적입니다. SMA로 세제가 없는 상태를 테스트하는 경우 SEC 버퍼에서 세제를 완전히 생략해야 합니다. 그러나 세제 스크리닝을 위한 프로토콜 수정에 대한 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오. 2. FSEC를 위한 시료 전처리 세포 펠릿을 준비합니다.참고: 분석의 시작점은 관심 있는 GFP 태그(또는 기타 형광 표지) 단백질의 현탁액 세포 발현 배양물에서 세포 펠릿을 수확하는 것입니다. 수확을 위한 정확한 시기와 조건은 발현되는 단백질, 사용되는 세포주, 성장한 세포의 조건 및 단백질 발현이 유도된 방법에 따라 달라집니다. 이러한 세부 정보는 이 프로토콜의 범위를 벗어납니다. 이 연구에서는 P2 바큘로바이러스의 1:20 희석액의 약 4 x 106 생존 세포/mL로 감염 2-3일 후 25-50mL의 배양물에 해당하는 테스트 조건당 21-20g의 Sf20 세포 펠릿을 사용했습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 테스트를 거쳐 다른 진핵 세포주(예: HEK293E)의 유사한 습식 중량의 세포 펠릿에서도 동일하게 잘 작동하는 것으로 밝혀졌습니다.현탁 배양액의 세포를 수확할 준비가 되면 25-50mL 배양 분취액을 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 튜브의 균형을 맞추고 실온에서 15분 동안 2,000 x g의 스윙 아웃 버킷(재료 표 참조)에 탁상용 원심분리기를 사용하여 세포를 펠릿화합니다. 배양 상층액을 부드럽게 기울여 제거하고 버리거나, 세포 펠릿이 특히 느슨한 경우 피펫 필러와 함께 50mL 피펫을 사용합니다. 세포를 분석에 즉시 사용할 경우 세포 펠릿을 얼음 위에 놓고 5단계로 바로 진행합니다. 세포가 나중 단계에서 사용하기 위해 저장되어야 하는 경우, 세포를 -80°C에 두어 동결시킨다. 세포 펠릿이 -80°C에서 보관된 경우 실온에서 15분 동안 또는 샘플이 더 이상 얼지 않을 때까지 배양하여 빠르게 해동합니다. 이 단계에 따라 샘플을 즉시 얼음으로 옮깁니다. 샘플을 재현탁하고 가용화합니다.2mL의 가용화 완충액(단계 1.2)을 세포 펠릿에 추가합니다. 균질해질 때까지 4°C에서 15-30분 동안 end-over-end 반전으로 배양합니다. 최종 농도가 1% DDM/0.1% CHS가 되도록 미리 혼합된 세제 스톡(1.1단계)(예: 100% DDM/2% CHS 스톡의 2μL)을 추가합니다. 4°C에서 종단 반전으로 30분 동안 가용화합니다.알림: 원하는 경우 여러 조건을 병렬로 테스트할 수 있습니다. 한 번에 처리할 수 있는 병렬 샘플의 수는 SEC 실험을 실행하는 데 사용할 수 있는 시스템에 따라 다릅니다. 여기에 설명된 설정에서는 한 번에 최대 5개의 샘플을 처리할 수 있었습니다. 저속 원심분리 단계를 수행합니다.샘플을 2,000 x g 의 스윙 아웃 버킷에서 사전 냉각된(4°C) 탁상형 원심분리기에서 15분 동안 원심분리합니다. 고속 원심분리 단계를 수행합니다.5mL 주사기에 부착된 무딘 끝 바늘을 사용하여 저속 원심분리에서 초원심분리 튜브(예: 0.5-2mL 튜브)로 상층액을 조심스럽게 옮기고 저속 스핀에서 펠릿을 방해하지 않도록 주의합니다. 튜브 쌍의 균형을 0.05g 이내로 맞추고 고정각 초원심분리 로터에 넣습니다( 재료 표 참조). 250,000 x g에서 30분 동안 4°C에서 원심분리합니다. 3. 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC) 시스템을 준비하고 컬럼을 평형화합니다.예를 들어 제조업체의 지침에 따라 시스템을 준비합니다( 재료 표 참조). 예를 들어ample, 시스템에 SEC 버퍼를 채우고 펌프 공기를 제거합니다. SEC 컬럼을 FPLC에 연결하여 컬럼에 공기가 들어가지 않도록 합니다. 이는 FPLC 시스템의 유동 경로와 드롭 투 드롭 연결을 수행하기 위해 물로 채워진 주사기(컬럼 하단에 부착됨)로 SEC 컬럼에 배압을 가함으로써 달성됩니다. 실험실 등급의 증류 및 여과된H2O의 1.5 컬럼 부피(24mL 컬럼의 경우 36mL)에서 먼저 세척한 다음, 컬럼에 대한 권장 유속 및 압력으로 1.5 컬럼 부피의 SEC 버퍼로 세척하여 SEC 컬럼을 사전 평형화합니다( 재료 표 참조).참고: FSEC를 수행하기 위해 이 연구에 사용된 FPLC 시스템은 추운 환경에 있었고 5위치 루프 밸브와 6위치 플레이트 분획 수집기가 장착되어 있었습니다. 이 설정을 사용하면 5개의 샘플을 로드하고 실행 사이에 수동 개입 없이 자동화된 방식으로 동일한 컬럼 아래로 순차적으로 실행할 수 있습니다. SEC 실험을 실행하기 위해 상업적으로 이용 가능한 사전 충전된 24mL 컬럼을 사용했으며( 재료 표 참조), 여기에는 10-600kDa의 분자량 범위의 단백질을 분해할 수 있는 수지가 포함되어 있습니다. 관심 단백질이 특히 큰 경우 대체 컬럼 매트릭스를 대신 사용하여 분자량이 최대 5,000kDa인 단백질을 분리할 수 있습니다. 세제/지질 미셀의 존재는 사용된 단백질과 세제에 따라 막 단백질의 전체 크기를 >150kDa 증가시킵니다. 컬럼에 샘플을 적용하고 SEC 실험을 실행합니다.주사기에 부착된 무딘 끝 바늘을 사용하여 고속 원심분리 단계에서 상청액을 1mL 주사기로 옮깁니다. 이를 통해 펠릿을 방해하지 않고 원심분리기 튜브에서 샘플을 회수할 수 있습니다. 샘플 루프를 로드하도록 설정합니다. 주사기에서 600-700 μL의 샘플을 로딩 포트로 주입하여 500 μL 샘플 루프를 오버필합니다. 사용하는 시스템에 따라 이 로딩 단계를 방법에 프로그래밍하여 실수가 없도록 할 수 있습니다. 분석법 중에 컬럼의 권장 유속과 압력으로 4mL의 SEC 버퍼로 비우는 방식으로 루프의 샘플을 컬럼에 주입합니다( 재료 표 참조). 1.5 컬럼 부피(24 mL 컬럼의 경우 36 mL)의 버퍼가 통과할 때까지 동일한 유속으로 컬럼을 실행합니다. 컬럼 부피의 0.25(24mL 컬럼의 경우 6mL)에서 90개의 분획을 수집하기 위해 0.2mL 분획 수집을 시작합니다.참고: 컬럼의 공극 부피는 0.3 컬럼 부피가 될 것으로 예상되므로, 그 직전에 분획 수집을 시작하면 공극 부피에 존재하는 모든 단백질을 포함하여 모든 단백질의 용출이 모니터링됩니다. 4. 형광 추적 수집 및 분석 분획 수집기(단계 3.2.5)에서 샘플을 96웰 플레이트로 옮기고 형광 신호를 판독합니다.형광 판독을 하기 전에 수집된 샘플을 희석하십시오. 멀티-채널 피펫을 이용하여, 90 μL의 실험실 등급의 증류된H2O를 저장소로부터 불투명한 평평한 바닥 96-웰 플레이트의 각각의 웰로 옮긴다( 재료의 표 참조). 3.2.5 단계 동안 분획을 96웰 블록으로 수집한 경우 다중 채널 피펫을 사용하여 블록에서 SEC 분획 10μL를 불투명 평평한 바닥 96웰 플레이트로 옮기고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 그렇지 않은 경우, SEC 분획이 3.2.5 단계 동안 개별 튜브에 수집되는 경우, 각 분획의 10 μL을 불투명 평평한 바닥 96-웰 플레이트에 하나씩 옮기고, 샘플을 혼합하기 위해 매번 위아래로 피펫팅합니다. 불투명한 평평한 바닥 96웰 플레이트를 플레이트 판독기에 넣고 형광을 측정합니다. GFP가 형광 라벨(여기에 사용됨)인 경우 여기를 가능한 한 488nm에 가깝게 설정하고 형광 방출을 가능한 한 507nm에 가깝게 감지합니다.참고: 형광 판독을 수행하기 전에 필요한 희석은 발현 배양에 존재하는 관심 단백질의 총량과 사용 중인 플레이트 리더의 민감도에 따라 달라집니다. 이 연구에서 제시된 예에서, 샘플을 물에 10배 희석하였다. 출발점에 대한 제안으로, 분획은 검출 전에 물이나 완충액에 5-10배 희석해야 합니다. 기록된 FSEC 미량 신호가 특히 낮은 경우 더 작은 희석액 또는 희석되지 않은 시료를 대신 사용할 수 있습니다. 이 연구에서 검출에 사용된 장치는 488nm에서 여기가 가능하고 507nm에서 형광 방출을 감지할 수 있는 플레이트 리더였습니다( 재료 표 참조). FSEC 추적을 플로팅합니다.플레이트 리더의 데이터를 원시 형식(원시 텍스트 또는 쉼표로 구분된 값 파일)으로 내보냅니다. 이러한 원시 데이터는 FSEC 추적의 Y축에 그려집니다. X축의 경우 각 분수가 수집된 부피를 계산합니다. 첫 번째 웰은 분획 지연을 설명하기 위해 첫 번째 분획이 수집된 용리 부피여야 합니다(이 예에서는 6mL). 이 이후의 분획은 수집된 분획 부피(이 예에서는 0.2mL)만큼 순차적으로 증가해야 합니다. X축 및 Y축 데이터가 계산되면 데이터를 복사하여 그래프 소프트웨어( 재료 표 참조)에 붙여넣어 각 웰의 형광 신호를 컬럼에서 용리된 부피에 대해 플로팅합니다.참고: 그림 1 은 FSEC 실험을 실행하는 데 필요한 단계를 개략적으로 나타낸 것입니다. FSEC 추적을 분석합니다.공극 부피(24mL 컬럼의 경우 약 8mL)에서 단백질 용리량을 평가하며, 이는 단백질의 크기가 매우 크고 펼쳐지거나 응집될 가능성이 있음을 나타냅니다. 접힌 단백질을 나타내는 이후 피크에서 용리되는 단백질의 양을 평가합니다. 이것은 단백질 크기(세제/지질 미셀과 관련된 경우)에 따라 24mL 컬럼의 경우 10mL에서 16mL 사이일 것으로 예상됩니다. 특히 3-4 mL(24 mL 컬럼의 경우)보다 크거나 넓은 피크인 경우 피크 모양에 세심한 주의를 기울이십시오. 단량체 피크에 기록된 최대 신호를 공극 피크의 최대 신호로 나누어 단량체 피크 높이와 공극 피크 높이 사이의 비율을 계산합니다.참고: 이 값은 단분산 지수를 나타내며 단백질 품질을 정량적으로 측정할 수 있습니다. 값이 클수록 최상의 품질을 나타내는 반면, 1보다 작은 값은 접힌 단백질보다 응집된 단백질이 더 많기 때문에 문제가 있는 샘플을 나타냅니다. 여러 FSEC 실행을 비교해야 하고 가장 중요한 특징이 각 경우의 단량체의 양인 경우 트레이스를 플레이트 리더(예: RFU)에 의해 기록된 원시 신호로 플로팅합니다.참고: 풀린 단백질과 비교한 단량체의 양을 비교하는 것이 더 중요한 경우, 신호는 백분율로 정규화되어야 합니다.tage 트레이스의 최소 및 최대 판독값을 사용하여 전체 신호의 백분율로 변환해야 하며, 이는 트레이스 사이의 응집된 단백질과 단량체 단백질 간의 비율 차이를 강조합니다. 그림 1: FSEC 실험을 실행하는 데 필요한 단계를 개략적으로 보여줍니다. (1) 형광 태그가 부착된 관심 단백질을 발현하는 세포가 가용화됩니다. (2) 미정제 가용화는 먼저 저속 스핀으로 정화 된 다음 (3) 고속 스핀으로 명확 해집니다. (4) 정화된 샘플 상청액을 로드하여 적절한 SEC 컬럼에서 실행하고, (5) 분획을 수집합니다. (6) 분획 샘플을 96웰 플레이트로 옮기고 플레이트 리더를 사용하여 GFP-형광 신호를 검출하여 (7) FSEC 트레이스를 플로팅합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.