げっ歯類の腸虚血再灌流障害(IRI)の広く使用されている外科モデルを生成する方法について説明します。この手順では、上腸間膜動脈の閉塞とそれに続く血流の回復が含まれます。このモデルは、獣医学とヒト医学の両方において、腸管IRIの閉塞性の原因を調査する研究に有用です。
腸虚血再灌流障害(IRI)は、獣医学と人間医学の両方において無数の状態に関連しています。胃拡張軸捻転(GDV)、腸間膜捻転、疝痛などの腸内IRI状態は、犬や馬などの動物で観察されます。血流が最初に中断されると、組織が虚血状態になります。生組織を回収するために必要ですが、その後の再灌流はさらなる損傷を引き起こす可能性があります。IRIの主なメカニズムは、再灌流および損傷組織への酸素の再導入時のフリーラジカル形成ですが、他にも多くの成分が関与しています。結果として生じる局所的および全身的影響は、しばしば予後不良をもたらす。
腸管IRIは、過去50年以上にわたって広範な研究の対象となってきました。上腸間膜動脈(SMA)の基部を一時的に結紮する in vivo げっ歯類モデルは、現在、腸内IRIの研究に使用される最も一般的な方法です。ここでは、小腸の一貫した組織病理学によって実証されているように、再現性のある損傷をもたらす21%O2 医療用空気中のイソフルラン麻酔を利用した腸IRIのモデルについて説明します。結腸、肝臓、腎臓の組織損傷も評価されました。
虚血再灌流障害(IRI)は、どの臓器でも発生する可能性があり、2つの連続した構成要素が関与します。血流が最初に停止すると、罹患した組織が虚血性になり、その後の再灌流がさらなる細胞損傷を誘発します。再灌流による損傷は、虚血によって引き起こされる損傷をしばしば上回ります1。IRIの病態生理学には複雑な事象のカスケードが関与しており、その中でも最も注目すべきは、再灌流中に発生する酸素の再導入時のフリーラジカル形成である2。炎症細胞とサイトカインの活性化も役割を果たします2。腸管IRIの場合、内皮損傷後の細菌の血流への移行は、全身性炎症反応症候群につながる可能性があります2。IRIによる損傷が十分に深刻な場合、結果として生じる全身への影響は多臓器不全につながる可能性があります3。
腸内IRIの症例は、高い罹患率と死亡率に関連しています4,5,6。腸IRIは、獣医学と人間医学の両方において、多くの病理学的状態および外科的処置に関連しています。獣医学では、動物は胃拡張軸捻転(GDV)、腸間膜捻転、疝痛7,8などの腸IRI状態に特にかかりやすいです。ヒトでは、腹部大動脈瘤手術、絞扼ヘルニア、急性腸間膜虚血、軸捻転、外傷、ショック、新生児壊死性腸炎、小腸切除または移植において、IRIは主要かつ頻繁に発生する問題です9。
腸内IRIのほとんどのin vivoげっ歯類研究には、小腸の大部分と大腸の近位部に血液を供給する腹部大動脈の枝である上腸間膜動脈(SMA)の基部の閉塞が含まれます10,11,12。このモデルが広く使用されており、比較的単純であるにもかかわらず、21% O2 医療用空気中の吸入麻酔を使用する詳細なプロトコルは公開されていません。標準的なプロトコルがないため、手順に不慣れな研究者にとっては困難であり、研究間の一貫性が妨げられます。8〜14週齢の雌雄のスイスウェブスターマウスで腸内IRIの外科的モデルを実施するために必要な手順を示します。腸IRIのこのモデルは、一貫した組織病理学によって実証されているように、再現性のある損傷をもたらします。
この腸内IRIモデルが広く使用されているにもかかわらず、限界がないわけではありません。例えば、SMAの基部だけを閉塞しても、腸への血流が完全に遮断されるわけではありません。これは、腸間膜の側副循環が広範囲にあり、腹部大動脈の隣接する枝から血液を採取できるためと考えられます。猫を用いた1件の研究では、SMA閉塞により、血流が近位十二指腸で35%、遠位十二指腸で61%、空腸と回腸で71%、近位結腸で63%減少しました。血流は、下腸間膜動脈23から循環の多くを受け取る中部および遠位結腸では減少しなかった。げっ歯類では、空腸と回腸は、SMA閉塞後に最も重大な組織損傷を負う腸セグメントとして最もよく引用されます9。
SMA閉塞後の虚血時間は、1分から90分以上まで、文献に引用されています。虚血時間が異なれば、再灌流損傷のレベルも異なります。Parkらは、虚血間隔が40分から60分の間であれば再灌流傷害を観察したが、虚血間隔が短かったり長かったりするとは観察しなかった24。このような結果は、時間が短いほど再灌流障害を誘発するのに十分な虚血を生じさせないが、時間を長くすると組織にひどく損傷を与え、その後の再灌流損傷を実証することが不可能であることを示唆している。さらに、虚血時間が長いほど、死亡率が上昇するリスクがあります。私たちの研究で見られるように、60分間の虚血を受けた最初のマウスの50%(3/6)は、わずか90分間の再灌流後に死亡しました。虚血時間を45分に短縮すると、組織損傷スコアを変更することなく死亡率が20%(1/5)に低下しました。私たちの研究に基づくと、虚血性損傷の理想的なウィンドウは、約45分間のSMA閉塞によって達成できるようです。
別の変数は、組織採取前の再灌流時間です。虚血時間と同様に、再灌流時間は60分から24時間以上まで、研究によって大きく異なります。いくつかの論文は、腸粘膜が2〜3時間の再灌流で最大の形態学的損傷を負い、24時間25,26,27で完全な修復が達成されることを報告しています。この2〜3時間前に組織を採取すると、再灌流損傷の全容を捉えられないリスクがありますが、24時間近くで採取された組織はすでに修復プロセスを開始しています。当初は120分の再灌流時間を選択したが、死亡率を下げるために90分に変更した。この変化は組織損傷の結果に変化を及ぼさず、2〜3時間のウィンドウから30分の偏差が許容可能であることを示唆しています。
酸素濃度もIRIの開発における重要な変数です。Wildingらは、21%O2を投与されたマウスと比較して、100%O2を投与されたイソフルランで麻酔されたマウスは、無気肺による換気-灌流の不一致を経験したことを発見しました。同じ研究で、100%O2を投与されたラットは急性呼吸アシドーシスを発症し、平均動脈圧が上昇した28。このような生理学的変化は、多くの全身的要因が関与するIRIなどの傷害を誘発する場合に最もよく避けられます。したがって、イソフルラン送達のキャリアガスとしては、100%O2よりも21%O2の方が適切であるように思われる。
このプロトコルでのヘパリンの使用については議論の余地があります。ヘパリンは抗凝固作用と抗炎症作用があることが知られている29。60分の虚血と120分の再灌流から、45分の虚血と400IU/kgのヘパリンによる90分の再灌流に変更しても、顕微鏡的腸損傷は変わらなかったが、死亡率は低下した。考えられる説明の1つは、ヘパリンが肺や脳などの遠隔臓器への致命的な血栓塞栓症を予防したというものですが、死亡した最初の2匹のマウスの肉眼的または顕微鏡的検査による剖検では、この証拠は見つかりませんでした。ヘパリンを含まない虚血および再灌流時間を短くすることは、死亡率の低下に同様に効果的である可能性があります。その場合は、IRIへの干渉を最小限に抑えるためにヘパリンの使用を控えるのが賢明です。ただし、プロトコルにヘパリンを含めることは、外科患者が周術期にヘパリンを受け取ることが多いため、IRIの外科的原因をモデル化したい人に適している可能性があります。
イソフルランは、腸の炎症や虚血の場合に組織保護効果があることが示されており、その使用は臨床的に関連するIRIモデル30,31,32を妨げる可能性があります。.しかし、有機フッ素吸入剤(すなわち、イソフルラン、セボフルラン)は、獣医学と人間医学の両方で一般的に使用されている麻酔薬です。さらに、このプロトコルに必要な麻酔の長さは120分を超え、吸入剤は再投与する必要がある短時間作用型注射剤よりも適切です。
近位結腸、肝臓、または腎臓に顕微鏡的病変は存在しなかった。微視的変化がなかったのは、おそらく90〜120分の再灌流時間が比較的短かったためです。.さらに、近位結腸には下腸間膜動脈からの血液供給があります。ただし、目に見える損傷がないからといって、全身の損傷を除外するものではありません。逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)は、TNF-αなどの炎症性サイトカインを測定することにより、全身損傷を実証するためのより良い方法論である可能性があります。
この腸内IRIモデルのいくつかのバリエーションが長年にわたって開発されてきました。1990年、Megisonらは、SMAに加えて側副血管を閉塞すると、腸間膜血流がより一貫して減少するが、死亡率が増加することを実証した33。より最近の研究では、SMAをその基部で閉塞させる代わりに、末梢枝と側副枝を結紮して回腸遠位部に虚血を誘発すると、死亡率なしで再現可能な損傷が得られることが示されました34。局所動脈枝の閉塞は、最大の虚血を保証し、SMAをその基部で結紮することで見られる血流の多発性、セグメント的な減少の問題に対処する可能性があります。腸内IRIをモデル化するこの代替法は、腸内IRIの局所組織への影響に関する研究に応用できますが、腸の損傷に関連する可能性のある全身性炎症と多臓器不全を正確にモデル化できるかどうかは不明です。
SMA閉塞は、すべてのタイプの腸管IRIに適したモデルではありません。例えば、非閉塞性腸間膜虚血は、心拍出量の低下に起因する内臓低灌流を特徴としています。したがって、この手法は、心筋梗塞、うっ血性心不全、大動脈弁機能不全、または腎疾患または肝疾患によって引き起こされる腸内IRIの研究には最適ではありません35。しかし、Kozarらは、SMA閉塞はショックによって誘発される腸内IRIの臨床的に関連するモデルであると報告した36。経済的ではありませんが、ブタなどの他の種の使用は、特定の腸の損傷状態をモデル化するためにげっ歯類よりも利点がある可能性があります。2014年のGonzalezらによる包括的なレビューでは、腸内IRIの調査に現在使用されている動物モデルが記述されています9。
その限界にもかかわらず、SMAをその基部で閉塞する技術は、腸虚血の最も一般的に利用されているげっ歯類モデルの1つであり続けています9。1つの血管クランプと基本的なセットアップのみで済むため、手術自体は非常に簡単です。また、ここに示したデータで証明されているように、再現性のある損傷も生じます。げっ歯類におけるSMA閉塞は、腸内IRIの閉塞原因を確実にモデル化することができ、獣医学とヒト医学の両方で実用化することができます。そのため、ここで概説した手順を一貫性を持って実行することが重要です。
The authors have nothing to disclose.
このプロジェクトの資金は、米国国立衛生研究所(NIH)の国立心肺血液研究所の学内研究部門から提供されました。
ジェームズ・ホーキンス博士の指導とサポートに感謝します。また、上腸間膜動脈の特定に協力してくれたMihai Oltean博士とRobert Linford博士にも感謝します。このプロトコルの開発中に専門知識を提供してくれたPatricia Carvalho Obeid Ellrich博士、Claudio Correa Natalini博士、George Howell III博士に感謝の意を表します。最後に、この論文で紹介した美しい顕微鏡写真の入手に協力してくれたStephen Wincovitch氏と、最終的な図のラベル付けとレンダリングを手伝ってくれたAlicia Olivier博士に感謝します。
Adson forceps | Roboz | RS-5236 | Surgical instrument |
Alm retractor | Roboz | RS-6510 | Surgical instrument |
Anesthesia machine | Datex-Ohmeda | Aestiva 5 | |
Anesthesia: isoflurane | Baxter Healthcare Corporation | NDC 10019-360-40 | Dose: 1-4%, INH |
Angiocath 20 g x 2 | Smiths Medical | 5057 | Flushing intestines with saline and formalin |
Atraumatic microvascular clip | Teleflex | 065100 | Surgical instrument |
Buffered formalin 10% | Fisher Scientific | 23-245684 | Tissue fixation |
Bupivicaine 0.25% | Hospira, Inc. | NDC 0409-1160-18 | Dose: up to 2 mg/kg drop-wise |
Buprenorphine | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | Dose: 1 mg/kg, SQ |
Chlorhexidine scrub 2% | Vet One | 510083 | Surgical site prep |
Circulating water blanket | Cincinnati Sub Zero | Blanketrol 2 | Body temp maintenance |
Clippers – Wahl BravMini, Purple Hair clippers | Lambert Vet Supply | 008WA-41590-0438 | Surgical site prep |
Conical tubes 50 ml | Fisher Scientific | 14-432-22 | Tissue fixation and storage |
Dry ice | N/A | N/A | PCR tissue samples |
EtOH 200 proof | The Warner-Graham Company | 64-17-5 | Tissue storage |
Heparin (optional) | Meitheal Pharmaceuticals | NDC 71288-402-11 | Dose: 200-600 IU/kg |
Induction chamber | VetEquip | 941456 | |
Indus Instruments THM100 Rodent Monitor | Indus Instruments | N/A | For monitoring rodent body temperature during surgery |
Isopropyl Alcohol 70% | Humco | NDC 0395-4202-28 | For scrubbing surgical site |
Microcentrifuge Tubes: 0.6mL | Fisher Scientific | 05-408-121 | PCR tissue samples. 8 per mouse, Terminal bleed collection, serum storage |
Microsoft Excel | Microsoft | N/A | |
Nose cone | N/A | N/A | Can be homemade with syringe tube or bubble tubing |
O2 medical air 21% | Roberts Oxygen | N/A | Rate: 0.5 L/min for each L chamber volume |
Ophthalmic ointment | Akorn, Inc. | NDC 17478-062-35 | Surgical prep |
PBS pH 7.4 (1x) | ThermoFisher Scientific | 10010-031 | For tissue rinsing and making 70% EtOH |
Specimen cups | Cardinal Healthcare | C13005 | For holding tissue cassettes in formalin |
Sterile Castroviejo Needle Holder | Roboz | RS-6412 | Surgical instrument |
Sterile cotton swabs | Medline | BXTA50002Z | |
Sterile gauze | Medline | PRM21423Z | |
Sterile Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5980 | Surgical instrument |
Sterile micro dissecting spring scissors | Roboz | RS-5693 | Surgical instrument |
Sterile micro forceps | Roboz | RS-5264 | Surgical instrument |
Sterile saline (0.9%) | Braun | R5201-01 | Must be warmed |
Sterile scalpel blade #15 | Cardinal Health (Allegiance) | 32295-015 | Surgical instrument |
Sterile scalpel handle | Roboz | RS-9843 | Surgical instrument |
Sterile surgical drape | Medline | DYNJSD1092 | |
Sterile surgical gloves | Medline | MSG2270 | |
Sterile surgical stapler | Roboz | RS-9260 | Surgical instrument |
Sterile surgical staples | Roboz | RS-9262 | Abdominal skin closure |
Sterile suture: Vicryl (polyglactin 910) 6-0, 27" Taper RB-1 Needle | Ethicon | J212G | Closing abdominal muscle |
Surgical tape | Medline | MMM15271Z | Securing mouse in dorsal recumbancy |
Syringe 10 ml x 2 | Medline | SYR110010 | Flushing intestines with saline and formalin |
Tissue cassettes | Fisher Scientific | 22-038-665 | Rolled intestinal segments. 4 per mouse. |
Towel or drape | Medline | GEM2140 | Water blanket cover |