On-Tether Sülfonyum Merkezi Kullanarak Döngüsel Peptitlerin Oluşturulması
Summary
Bu protokol, sistein ve metiyonin arasındaki bisalkilasyon yoluyla siklik peptitlerin sentezini ve propargil sülfonyum merkezi tarafından tetiklenen fakil tiol-yne reaksiyonunu sunar.
Abstract
Son yıllarda, siklik peptitler, mükemmel biyolojik aktiviteleri nedeniyle ilaç keşfi alanında giderek daha fazla dikkat çekmektedir ve sonuç olarak, şimdi klinik olarak kullanılmaktadırlar. Bu nedenle, ilaç keşfi alanındaki uygulamalarını teşvik etmek için siklik peptitleri sentezlemek için etkili stratejiler aramak çok önemlidir. Bu yazıda, on-reçine veya intramoleküler (moleküller arası) bisalkilasyon kullanılarak siklik peptitlerin etkin sentezi için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol kullanılarak, lineer peptitler, reçine üzerinde aynı anda bağlanmış sistein (Cys) ve metiyonin (Met) ile katı faz peptid sentezinden yararlanılarak sentezlendi. Ayrıca, siklik peptitler, ayarlanabilir bir tether ve bir tether sülfonyum merkezi kullanılarak Met ve Cys arasında bisalkilasyon yoluyla sentezlendi. Tüm sentetik yol üç ana sürece ayrılabilir: reçine üzerindeki Cys’nin korunmasının azaltılması, bağlayıcının bağlanması ve bir trifloroasetik asit (TFA) bölünme çözeltisinde Cys ve Met arasındaki döngüselleşme. Ayrıca, sülfonyum merkezinin reaktivitesinden esinlenerek, tiol-yne ilavesini tetiklemek ve siklik bir peptit oluşturmak için Met’e bir propargil grubu bağlandı. Bundan sonra, ham peptitler kurutuldu ve asetonitril içinde çözüldü, ayrıldı ve daha sonra yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile saflaştırıldı. Siklik peptidin moleküler ağırlığı, sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) ile doğrulandı ve indirgeyici ile siklik peptid kombinasyonunun stabilitesi HPLC kullanılarak daha da doğrulandı. Ek olarak, siklik peptitteki kimyasal kayma, 1 H nükleer manyetik rezonans (1H NMR) spektrumu ile analiz edildi. Genel olarak, bu protokol siklik peptitlerin sentezlenmesi için etkili bir strateji oluşturmayı amaçlamıştır.
Introduction
Protein-protein etkileşimleri (PPI’lar)1, ilaç araştırma ve geliştirmede çok önemli bir rol oynamaktadır. Stabilize peptitlerin kimyasal yollarla sabit bir konformasyonla oluşturulması, PPI’ların mimetik motiflerini geliştirmek için en önemli yöntemlerden biridir2. Bugüne kadar, ÜFE’leri hedef alan birkaç siklik peptit klinik kullanım için geliştirilmiştir3. Çoğu peptit, konformasyonel entropiyi azaltmak ve metabolik stabiliteyi, hedef bağlama afinitesini ve hücre geçirgenliğini iyileştirmek için bir α-sarmal konformasyonu ile sınırlıdır 4,5. Son 2 yılda, Cys6,7, lizin8,9, triptofan 10, arginin 11 ve Met12,13’ün yan zincirleri, peptidi siklik bir konformasyona sabitlemek için doğal olmayan amino asitlere yerleştirilmiştir. Bu tür siklik peptitler benzersiz bir kimyasal alanı veya özel bölgeleri hedefleyebilir, böylece protein-peptit kovalent bağlanması14,15,16,17 oluşturmak için kovalent bir reaksiyonu tetikleyebilir. Yu ve ark. tarafından yakın zamanda yayınlanan bir raporda, peptid ligandlarının alanına bir kloroasetamid tutturulmuş ve mükemmel protein özgüllüğü18 ile kovalent bir konjugasyon reaksiyonu sağlanmıştır. Ayrıca, akrilamid ve aril sülfonil florür (ArSO2F) gibi elektrofilik savaş başlıkları, stabilize peptid kovalent inhibitörleri oluşturmak ve peptid inhibitörlerinin anti-tümör etkisini iyileştirmek için Walensky ve ark.19 tarafından peptitlere daha fazla dahil edilmiştir. Bu nedenle, protein-peptid ligandlarını kovalent olarak modifiye etmek için ek bir fonksiyonel grup tanıtmak çok önemlidir20. Bu gruplar sadece yan zincirdeki proteinlerle reaksiyona girmekle kalmaz, aynı zamanda peptid21’in ikincil yapısını da stabilize eder. Bununla birlikte, peptid ligandları tarafından indüklenen kovalent modifiye proteinlerin uygulanması, karmaşık sentetik yol ve kimyasal grupların spesifik olmayan bağlanması nedeniyle sınırlıdır22,23. Bu nedenle, siklik peptitlerin sentezi için etkili stratejiler acilen gereklidir.
2,24,25,26 siklik peptitlerin çok yönlü stratejilerinden esinlenen bu protokol, peptitleri stabilize etmek için basit ve etkili bir yöntem geliştirmeye çalışır. Ek olarak, kararlı bir peptidin yan zincir grubunun, peptid ligandlarına mekansal olarak yakın olduğunda bir hedef protein ile kovalent olarak reaksiyona girebileceğini belirttik. Kimyasal olarak modifiye edilmiş Met’in eksikliği, 2013 yılında Deming grubu tarafından, seçici olarak modifiye edilmiş peptid metiyonin27 üretmek için yeni bir yöntem geliştirilerek dolduruldu. Bu arka plana dayanarak, Shi ve ark. bir sülfonyum tuz merkezi oluşturmak için yan zincirlerin halka kapanmasının geliştirilmesine odaklandı. Peptit ligandı hedef protein ile birleştiğinde, sülfonyum tuzu grubu, mekansal olarak yakın Cys proteini ile kovalent olarak reaksiyona girer. Son yıllarda, Shi ve ark. siklik peptid28’i stabilize etmek için yeni bir yöntem tasarladılar. Siklik peptit üzerindeki sülfonyum tuzu, geri dönüşümlü olarak Met’e indirgenmiş bir sülfhidril grubuna sahip bir indirgeyici ajan tarafından indirgenmiştir. Bununla birlikte, reaksiyon düşük verimliliğe sahipti ve bu da sonraki biyolojik uygulama çalışmalarına zararlıydı. Bu çalışmada, siklik peptidin yan zincirinde kalan tek bir sülfonyum tuzu ile bir Met-Cys ve propargil bromür-Cys halka kapatma reaksiyonu tasarlanmıştır. Sülfonyum tuzu, uzaysal yakınlık altında Cys proteini ile kovalent olarak reaksiyona giren yeni bir savaş başlığı görevi gördü. Kısaca, bir Cys ve Met mutasyona uğramış peptid, molekül içi alkilasyon ile siklize edildi ve bu da bir on-tether sülfonyum merkezinin üretilmesiyle sonuçlandı. Bu süreçte, bir yan zincir köprüsünün oluşumu siklik peptitler için kritik öneme sahipti. Genel olarak, bu protokol, basit reaksiyon koşulları ve işlemleri kullanılarak elde edilen ayrıntılı bir sülfonyum bazlı peptid siklizasyonunu tanımlar. Amaç, daha geniş biyolojik uygulamalar için potansiyel bir yöntem geliştirmektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda açıklanan sentetik yaklaşım, temel lineer peptitlerin ortak katı faz peptid sentez teknikleri ile oluşturulduğu peptid dizisinde Cys ve Met kullanarak siklik peptidlerin sentezlenmesi için bir yöntem sunmaktadır. Cys ve Met arasındaki siklik peptitlerin bisalkilasyonu için, tüm sentetik yol üç ana sürece ayrılabilir: reçine üzerindeki Cys’nin korunmasının azaltılması, bağlayıcının bağlanması ve bir trifloroasetik asit bölünme çözeltisinde Cys ve Met arasındaki siklikleşme. Ö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı’nın (2021YFC2103900) finansal desteğini kabul ediyoruz; Çin Doğa Bilimleri Vakfı hibe (21778009 ve 21977010); Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (2022A1515010996 ve 2020A1515010521): Shenzhen Bilim ve Teknoloji İnovasyon Komitesi, (RCJC20200714114433053, JCYJ201805081522131455 ve JCYJ20200109140406047); ve Shenzhen-Hong Kong Beyin Bilimi Enstitüsü-Shenzhen Temel Araştırma Kurumları hibesi (2019SHIBS0004). Yazarlar, referans 30 için Chemical Science, The Royal Society of Chemistry ve referans 31 için The Journal of Organic Chemistry, American Chemical Society’den dergi desteğini kabul etmektedir.
Materials
| 1,3-bis(bromomethyl)-benzen | Energy | D0215 | |
| 1,3-Dimethylbarbituric acid | Energy | A46873 | |
| 1H NMR and HSQC | Bruker | AVANCE-III 400 | |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate | Energy | E020543 | |
| 2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) | Energy | A1797 | |
| 2-mercaptopyridine | Energy | Y31130 | |
| 6-Aminocaproic acid | Energy | A010678 | |
| Acetic anhydride | Energy | A01021454 | |
| Acetonitrile | Aldrich | 9758 | |
| Ammonium carbonate | Energy | 12980 | |
| Dichloromethane (DCM) | Energy | W330229 | |
| Digital Heating Cooling Drybath | Thermo Scientific | 88880029 | |
| Diisopropylethylamine (DIPEA) | Energy | W320014 | |
| Dimethyl formamide (DMF) | Energy | B020051 | |
| Dithiothreitol | Energy | A10027 | |
| Electrospray Ionization Mass | SHIMADZU2020 | LC-MS2020 | |
| Fmoc-Ala-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30101 | |
| Fmoc-Arg(Pbf)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30201 | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30501 | |
| Fmoc-Gln(Trt)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30601 | |
| Fmoc-Glu(OtBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30701 | |
| Fmoc-His(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30902 | |
| Fmoc-Ile-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31001 | |
| Fmoc-Lys(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31201 | |
| Fmoc-Met-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31301 | |
| Fmoc-Pro-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31501 | |
| Fmoc-Ser(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31601 | |
| Fmoc-Thr(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31701 | |
| Fmoc-Trp(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31801 | |
| Fmoc-Tyr(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31901 | |
| Fmoc-Val-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R32001 | |
| Formic acid | Energy | W810042 | |
| High Performance Liquid Chromatography |
SHIMADZU | LC-2030 | |
| Methanol | Aldrich | 9758 | |
| Morpholine | Aldrich | M109062 | |
| N,N'-Diisopropylcarbodiimide | Energy | B010023 | |
| Ninhydrin Reagent | Energy | N7285 | |
| Propargyl bromide | Energy | W320293 | |
| Rink Amide MBHA resin | Nanjing Peptide Biotech Ltd. | ||
| Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates | Thermo Scientific | 60300-403 | |
| Tetrakis(triphenylphosphine) palladium | Energy | T1350 | |
| Three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
| Triethylamine | Energy | B010737 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | J&K | 101398 | |
| Triisopropylsilane (TIS) | Energy | T1533 |
References
- Arkin, M. R., Tang, Y. Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: Progressing toward the reality. Chemistry Biology. 21 (9), 1102-1114 (2014).
- Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bis-alkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
- Muttenthaler, M., King, G. F., Adams, D. J., Alewood, P. F. Trends in peptide drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (4), 309-325 (2021).
- White, C. J., Yudin, A. K. Contemporary strategies for peptide macrocyclization. Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).
- Victoria, G. G., Reddy, S. R. Recent advances in the synthesis of organic chloramines and their insights into health care. New Journal of Chemistry. 45, 8386-8408 (2021).
- Kim, J. I., et al. Conformation and stereoselective reduction of hapten side chains in the antibody combining site. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9392-9394 (1991).
- Waddington, M. A., et al. An organometallic strategy for cysteine borylation. Journal of the American Chemical Society. 143 (23), 8661-8668 (2021).
- Luong, H. X., Bui, H. T. P., Tung, T. T. Application of the all-hydrocarbon stapling technique in the design of membrane-active peptides. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (4), 3026-3045 (2022).
- Góngora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
- Li, B., et al. Cooperative stapling of native peptides at lysine and tyrosine or arginine with formaldehyde. Angewandte Chemie International Edition. 60 (12), 6646-6652 (2021).
- Blaum, B. S., et al. Lysine and arginine side chains in glycosaminoglycan-protein complexes investigated by NMR, cross-Linking, and mass spectrometry: a case study of the factor h-heparin Interaction. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6374-6381 (2010).
- Petitdemange, R., et al. Selective tuning of elastin-like polypeptide properties via methionine oxidation. Biomacromolecules. 18 (2), 544-550 (2016).
- Kadlcik, V., et al. Reductive modification of a methionine residue in the amyloid-beta peptide. Angewandte Chemie International Edition. 45 (16), 259 (2006).
- Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).
- Reddy, C. B. R., et al. Antiviral activity of 3-(1-chloropiperidin-4-yl)-6-fluoro benzisoxazole 2 against white spot syndrome virus in freshwater crab, Paratelphusa hydrodomous. Aquaculture Research. 47 (8), 2677-2681 (2015).
- Embaby, A. M., Schoffelen, S., Kofoed, C., Meldal, M., Diness, F. Rational tuning of fluorobenzene probes for cysteine-selective protein modification. Angewandte Chemie International Edition. 57 (27), 8022-8026 (2018).
- Jiang, H. F., Chen, W. J., Wang, J., Zhang, R. S. Selective N-terminal modification of peptides and proteins: recent progresses and applications. Chinese Chemical Letters. 33 (1), 80-88 (2022).
- Yu, Y., et al. PDZ-reactive peptide activates ephrin-B reverse signaling and inhibits neuronal chemotaxis. ACS Chemical Biology. 11 (1), 149-158 (2016).
- Huhn, A. J., Guerra, R. M., Harvey, E. P., Bird, G. H., Walensky, L. D. Selective covalent targeting of anti-apoptotic BFL-1 by cysteine-reactive stapled peptide inhibitors. Cell Chemical Biology. 23 (9), 1123-1134 (2016).
- Chow, H. Y., Zhang, Y., Matheson, E., Li, X. C. Ligation technologies for the synthesis of cyclic peptides. Chemical Reviews. 119 (17), 9971-10001 (2019).
- Zhang, H. Y., Chen, S. Y. Cyclic peptide drugs approved in the last two decades (2001-2021). RSC Chemical Biology. 3 (1), 18-31 (2021).
- Lee, Y. J., Han, S. H., Lim, Y. B. Simultaneous stabilization and multimerization of a peptide alpha-helix by stapling polymerization. Macromolecular Rapid Communications. 37 (13), 1021-1026 (2016).
- Karthikeyan, K., et al. Anti-viral activity of methyl 1-chloro-7-methyl-2-propyl-1h-benzo[d] imidazole-5-carboxylate against white spot syndrome virus in freshwater crab (Paratelphusa hydrodromous). Aquaculture International. 30, 989-998 (2022).
- Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
- Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
- Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
- Kramer, J. R., Deming, T. J. Reversible chemoselective tagging and functionalization of methionine containing peptides. Chemical Communications. 49 (45), 5144-5146 (2013).
- Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bisalkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
- Merrifield, B. Solid phase synthesis. Nobel lecture, 8 December 1984. Bioscience Reports. 5 (5), 353-376 (1985).
- Wang, D. Y., et al. A sulfonium tethered peptide ligand rapidly and selectively modifies protein cysteine in vicinity. Chemical Science. 10 (19), 4966-4972 (2019).
- Hou, Z. F., et al. A sulfonium triggered thiol-yne reaction for cysteine modification. The Journal of Organic Chemistry. 85 (3), 1698-1705 (2020).
- Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).
