Detta protokoll presenterar syntesen av cykliska peptider via bisalkylering mellan cystein och metionin och den facila tiolen-yne-reaktionen som utlöses av propargylsulfoniumcentret.
Under de senaste åren har cykliska peptider väckt ökad uppmärksamhet inom läkemedelsupptäckt på grund av deras utmärkta biologiska aktiviteter, och som en följd av detta används de nu kliniskt. Det är därför viktigt att söka effektiva strategier för att syntetisera cykliska peptider för att främja deras tillämpning inom läkemedelsupptäckt. Detta dokument rapporterar ett detaljerat protokoll för effektiv syntes av cykliska peptider med användning av on-harts eller intramolekylär (intermolekylär) bisalkylering. Med hjälp av detta protokoll syntetiserades linjära peptider genom att dra nytta av fastfaspeptidsyntes med cystein (Cys) och metionin (Met) kopplade samtidigt på hartset. Vidare syntetiserades cykliska peptider via bisalkylering mellan Met och Cys med hjälp av en avstämbar tjuder och ett on-tether sulfoniumcenter. Hela den syntetiska vägen kan delas in i tre huvudprocesser: avskyddet av Cys på hartset, kopplingen av länkaren och cykliseringen mellan Cys och Met i en trifluorättiksyra (TFA) klyvningslösning. Dessutom, inspirerad av sulfoniumcentrets reaktivitet, fästes en propargylgrupp till Met för att utlösa tiolon-yne-tillsats och bilda en cyklisk peptid. Därefter torkades de råa peptiderna och löstes i acetonitril, separerades och renades sedan genom högpresterande vätskekromatografi (HPLC). Molekylvikten för den cykliska peptiden bekräftades genom vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS), och stabiliteten hos den cykliska peptidkombinationen med reduktanten bekräftades ytterligare med användning av HPLC. Dessutom analyserades det kemiska skiftet i den cykliska peptiden med 1 H kärnmagnetisk resonans (1H NMR) spektra. Sammantaget syftade detta protokoll till att upprätta en effektiv strategi för att syntetisera cykliska peptider.
Protein-proteininteraktioner (PPI)1 spelar en avgörande roll i läkemedelsforskning och utveckling. Att konstruera stabiliserade peptider med en fast konformation med kemiska medel är en av de viktigaste metoderna för att utveckla mimetiska motiv av PPI2. Hittills har flera cykliska peptider som riktar sig mot PPI utvecklats för klinisk användning3. De flesta peptider är begränsade till en α-helix-konformation för att minska konformationsentropin och förbättra den metaboliska stabiliteten, målbindande affinitet och cellpermeabilitet 4,5. Under de senaste 2 decennierna har sidokedjorna av Cys 6,7, lysin8,9, tryptofan 10, arginin 11 och Met12,13 satts in i onaturliga aminosyror för att fixera peptiden i en cyklisk konformation. Sådana cykliska peptider kan rikta in sig på ett unikt kemiskt utrymme eller speciella platser och därigenom utlösa en kovalent reaktion för att bilda protein-peptidkovalent bindning14,15,16,17. I en ny rapport från Yu et al., en kloracetamid förankrades på domänen för peptidligander, vilket säkerställde en kovalent konjugeringsreaktion med utmärkt proteinspecificitet18. Dessutom införlivades elektrofila stridsspetsar, såsom akrylamid och arylsulfonylfluorid (ArSO2F), ytterligare i peptider av Walensky et al.19 för att bilda stabiliserade peptidkovalenta hämmare och förbättra antitumöreffekten av peptidhämmare. Därför är det mycket viktigt att införa ytterligare en funktionell grupp för att kovalent modifiera proteinpeptidligander20. Dessa grupper reagerar inte bara med proteiner på sidokedjan utan stabiliserar också peptidens sekundära struktur21. Appliceringen av kovalent modifierade proteiner inducerade av peptidligander är emellertid begränsad på grund av den komplicerade syntetiska vägen och den ospecifika bindningen av de kemiska grupperna22,23. Effektiva strategier för syntes av cykliska peptider är därför brådskande.
Inspirerad av de mångsidiga strategierna för cykliska peptider 2,24,25,26, försöker detta protokoll utveckla en enkel och effektiv metod för att stabilisera peptider. Dessutom noterade vi att sidokedjegruppen i en stabil peptid kunde reagera kovalent med ett målprotein när det var rumsligt nära peptidliganderna. Bristen på kemiskt modifierad Met fylldes av Deming-gruppen 2013 genom att utveckla en ny metod för att producera selektivt modifierad peptidmetionin27. Baserat på denna bakgrund fokuserade Shi et al. på utvecklingen av ringförslutningen av sidokedjor för att bilda ett sulfoniumsaltcentrum. När peptidliganden kombineras med målproteinet reagerar sulfoniumsaltgruppen kovalent med det rumsligt nära Cys-proteinet. har under de senaste åren utformat en ny metod för att stabilisera cyklisk peptid28. Sulfoniumsaltet på den cykliska peptiden reducerades av ett reduktionsmedel med en sulfhydrylgrupp som reversibelt reducerades till Met. Reaktionen hade emellertid låg effektivitet, vilket var skadligt för efterföljande biologiska applikationsstudier. I den aktuella studien designades en Met-Cys- och propargylbromid-Cys-ringstängningsreaktion, med ett enda sulfoniumsalt kvar på sidokedjan av den cykliska peptiden. Sulfoniumsaltet fungerade som en ny stridsspets som reagerade kovalent med proteinet Cys under rumslig närhet. Kortfattat cyklades en Cys- och Met-muterad peptid genom intramolekylär alkylering, vilket resulterade i generering av ett on-tether sulfoniumcenter. I denna process var bildandet av en sidokedjebro avgörande för cykliska peptider. Sammantaget beskriver detta protokoll en detaljerad sulfoniumbaserad peptidcyklisering som uppnås med hjälp av enkla reaktionsbetingelser och operationer. Syftet är att utveckla en potentiell metod för ytterligare breda biologiska tillämpningar.
Det syntetiska tillvägagångssättet som beskrivs i detta dokument ger en metod för att syntetisera cykliska peptider med användning av Cys och Met i peptidsekvensen, där de grundläggande linjära peptiderna konstrueras av vanliga fastfaspeptidsyntestekniker. För bisalkylering av cykliska peptider mellan Cys och Met kan hela den syntetiska vägen delas in i tre huvudprocesser: avskyddet av Cys på hartset, kopplingen av länkaren och cykliseringen mellan Cys och Met i en trifluorättiksyraklyvningslösning. I synne…
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner ekonomiskt stöd från Kinas nationella nyckel-FoU-program (2021YFC2103900); Natural Science Foundation of China beviljar (21778009 och 21977010); Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen (2022A1515010996 och 2020A1515010521): Shenzhen Science and Technology Innovation Committee, (RCJC20200714114433053, JCYJ201805081522131455 och JCYJ20200109140406047); och Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science-Shenzhen Fundamental Research Institutions bidrag (2019SHIBS0004). Författarna erkänner tidskriftsstöd från Chemical Science, The Royal Society of Chemistry för referens 30 och Journal of Organic Chemistry, American Chemical Society, för referens 31.
1,3-bis(bromomethyl)-benzen | Energy | D0215 | |
1,3-Dimethylbarbituric acid | Energy | A46873 | |
1H NMR and HSQC | Bruker | AVANCE-III 400 | |
1-Hydroxybenzotriazole hydrate | Energy | E020543 | |
2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) | Energy | A1797 | |
2-mercaptopyridine | Energy | Y31130 | |
6-Aminocaproic acid | Energy | A010678 | |
Acetic anhydride | Energy | A01021454 | |
Acetonitrile | Aldrich | 9758 | |
Ammonium carbonate | Energy | 12980 | |
Dichloromethane (DCM) | Energy | W330229 | |
Digital Heating Cooling Drybath | Thermo Scientific | 88880029 | |
Diisopropylethylamine (DIPEA) | Energy | W320014 | |
Dimethyl formamide (DMF) | Energy | B020051 | |
Dithiothreitol | Energy | A10027 | |
Electrospray Ionization Mass | SHIMADZU2020 | LC-MS2020 | |
Fmoc-Ala-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30101 | |
Fmoc-Arg(Pbf)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30201 | |
Fmoc-Cys(Trt)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30501 | |
Fmoc-Gln(Trt)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30601 | |
Fmoc-Glu(OtBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30701 | |
Fmoc-His(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30902 | |
Fmoc-Ile-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31001 | |
Fmoc-Lys(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31201 | |
Fmoc-Met-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31301 | |
Fmoc-Pro-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31501 | |
Fmoc-Ser(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31601 | |
Fmoc-Thr(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31701 | |
Fmoc-Trp(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31801 | |
Fmoc-Tyr(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31901 | |
Fmoc-Val-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R32001 | |
Formic acid | Energy | W810042 | |
High Performance Liquid Chromatography |
SHIMADZU | LC-2030 | |
Methanol | Aldrich | 9758 | |
Morpholine | Aldrich | M109062 | |
N,N'-Diisopropylcarbodiimide | Energy | B010023 | |
Ninhydrin Reagent | Energy | N7285 | |
Propargyl bromide | Energy | W320293 | |
Rink Amide MBHA resin | Nanjing Peptide Biotech Ltd. | ||
Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates | Thermo Scientific | 60300-403 | |
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium | Energy | T1350 | |
Three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
Triethylamine | Energy | B010737 | |
Trifluoroacetic acid (TFA) | J&K | 101398 | |
Triisopropylsilane (TIS) | Energy | T1533 |