בניית פפטידים מחזוריים באמצעות מרכז סולפוניום על קשירה
Summary
פרוטוקול זה מציג את הסינתזה של פפטידים מחזוריים באמצעות ביסלקילציה בין ציסטאין למתיונין ואת תגובת תיול-ין המופעלת על ידי מרכז פרופרגיל סולפוניום.
Abstract
בשנים האחרונות, פפטידים מחזוריים מושכים תשומת לב גוברת בתחום גילוי התרופות בשל פעילותם הביולוגית המצוינת, וכתוצאה מכך הם משמשים כיום קלינית. לכן, חיוני לחפש אסטרטגיות יעילות לסינתזה של פפטידים מחזוריים כדי לקדם את יישומם בתחום גילוי התרופות. מאמר זה מדווח על פרוטוקול מפורט לסינתזה יעילה של פפטידים מחזוריים באמצעות ביסלקילציה תוך-מולקולרית או תוך-מולקולרית (בין-מולקולרית). באמצעות פרוטוקול זה, פפטידים ליניאריים סונתזו על ידי ניצול סינתזת פפטידים בפאזה מוצקה עם ציסטאין (Cys) ומתיונין (Met) המצומדים בו זמנית על השרף. יתר על כן, פפטידים מחזוריים סונתזו באמצעות ביסלקילציה בין Met ו- Cys באמצעות קשירה הניתנת לכוונון ומרכז סולפוניום על קשירה. ניתן לחלק את כל המסלול הסינתטי לשלושה תהליכים עיקריים: הגנה על Cys על השרף, צימוד המקשר, ומחזוריות בין Cys ו- Met בתמיסת ביקוע חומצה טריפלואורואצטית (TFA). יתר על כן, בהשראת התגובה של מרכז הסולפוניום, קבוצת פרופרגיל הוצמדה למטרופוליטן כדי לגרום לתוספת תיול-ין וליצור פפטיד מחזורי. לאחר מכן, הפפטידים הגולמיים יובשו והתמוססו באצטוניטריל, הופרדו ולאחר מכן טוהרו על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC). המשקל המולקולרי של הפפטיד המחזורי אושר על ידי ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית (LC-MS), והיציבות של שילוב הפפטיד המחזורי עם הרדוקטנט אושרה עוד יותר באמצעות HPLC. בנוסף, השינוי הכימי בפפטיד המחזורי נותח על ידי ספקטרום תהודה מגנטית גרעינית של 1 H (1H NMR). בסך הכל, פרוטוקול זה נועד לבסס אסטרטגיה יעילה לסינתזה של פפטידים מחזוריים.
Introduction
אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs)1 ממלאות תפקיד מרכזי במחקר ובפיתוח תרופות. בניית פפטידים מיוצבים עם קונפורמציה קבועה באמצעים כימיים היא אחת השיטות החשובות ביותר לפיתוח מוטיבים מימטיים של PPIs2. עד כה פותחו מספר פפטידים מחזוריים המכוונים ל-PPIs לשימוש קליני3. רוב הפפטידים מוגבלים לקונפורמציה של סליל α כדי להפחית את האנטרופיה הקונפורמציונית ולשפר את היציבות המטבולית, זיקת קשירת המטרה וחדירות התאים 4,5. בשני העשורים האחרונים, השרשראות הצדדיות של Cys 6,7, ליזין 8,9, טריפטופן 10, ארגינין 11ו-Met 12,13 הוכנסו לחומצות אמינו לא טבעיות כדי לקבע את הפפטיד לקונפורמציה מחזורית. פפטידים מחזוריים כאלה יכולים לכוון למרחב כימי ייחודי או לאתרים מיוחדים, ובכך לעורר תגובה קוולנטית ליצירת קוולנטית חלבונית-פפטידית קוולנטית14,15,16,17. בדו”ח שפורסם לאחרונה על ידי Yu et al., כלורואצטמיד עוגן בתחום של ליגנדות פפטידיות, מה שמבטיח תגובת הצמדה קוולנטית עם ספציפיות מצוינת לחלבון18. יתר על כן, ראשי נפץ אלקטרופיליים, כגון אקרילאמיד ואריל סולפוניל פלואוריד (ArSO2F), שולבו עוד יותר בפפטידים על ידי Walensky et al.19 כדי ליצור מעכבי פפטיד קוולנטיים מיוצבים ולשפר את ההשפעה האנטי-סרטנית של מעכבי פפטידים. לכן, חשוב מאוד להציג קבוצה פונקציונלית נוספת על מנת לשנות באופן קוולנטי ליגנדות חלבון-פפטיד20. קבוצות אלה לא רק מגיבות עם חלבונים בשרשרת הצדדית אלא גם מייצבות את המבנה המשני של הפפטיד21. עם זאת, היישום של חלבונים שעברו שינוי קוולנטי המושרה על ידי ליגנדות פפטידיות מוגבל בשל המסלול הסינתטי המסובך והקשירה הלא ספציפית של הקבוצות הכימיות22,23. אסטרטגיות יעילות לסינתזה של פפטידים מחזוריים נדרשים, אם כן, בדחיפות.
בהשראת האסטרטגיות הרב-גוניות של פפטידים מחזוריים 2,24,25,26, פרוטוקול זה מנסה לפתח שיטה פשוטה ויעילה לייצוב פפטידים. בנוסף, ציינו כי קבוצת השרשרת הצדדית של פפטיד יציב יכולה להגיב באופן קוולנטי עם חלבון מטרה כאשר הוא היה קרוב מרחבית לליגנדות הפפטידיות. את המחסור ב-Met שעבר שינוי כימי מימשה קבוצת דמינג ב-2013 על ידי פיתוח שיטה חדשנית לייצור פפטיד מתיונין27 שעבר שינוי סלקטיבי. בהתבסס על רקע זה, Shi et al. התמקדו בפיתוח סגירת הטבעת של שרשראות צדדיות ליצירת מרכז מלח סולפוניום. כאשר הליגנד הפפטידי משתלב עם חלבון המטרה, קבוצת מלח הסולפוניום מגיבה באופן קוולנטי עם חלבון Cys הקרוב מרחבית. בשנים האחרונות עיצבו בני שי ואחרים שיטה חדשה לייצוב פפטיד מחזורי28. מלח הסולפוניום שעל הפפטיד המחזורי הופחת על ידי חומר מחזר עם קבוצת סולפהידריל שהופחתה באופן הפיך ל-Met. עם זאת, התגובה הייתה בעלת יעילות נמוכה, מה שהזיק למחקרי יישומים ביולוגיים מאוחרים יותר. במחקר הנוכחי תוכננה תגובת סגירה טבעתית של Met-Cys ופרופרגיל ברומיד-Cys, כאשר מלח סולפוניום יחיד נותר על השרשרת הצדדית של הפפטיד המחזורי. מלח הסולפוניום פעל כראש נפץ חדש שהגיב באופן קוולנטי עם החלבון Cys בסמיכות מרחבית. בקצרה, פפטיד שעבר מוטציה ב-Cys ו-Met היה מחזורי על-ידי אלקילציה תוך-מולקולרית, וכתוצאה מכך נוצר מרכז סולפוניום על-קשירה. בתהליך זה, היווצרות גשר שרשרת צדדי הייתה קריטית עבור פפטידים מחזוריים. בסך הכל, פרוטוקול זה מתאר מחזוריות פפטידית מפורטת מבוססת סולפוניום המושגת באמצעות תנאי תגובה ופעולות פשוטות. המטרה היא לפתח שיטה פוטנציאלית ליישומים ביולוגיים רחבים נוספים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הגישה הסינתטית המתוארת במאמר זה מספקת שיטה לסינתזה של פפטידים מחזוריים באמצעות Cys ו-Met ברצף הפפטידים, שבו הפפטידים הליניאריים הבסיסיים בנויים על ידי טכניקות נפוצות של סינתזת פפטידים בפאזה מוצקה. לצורך ביסלקילציה של פפטידים מחזוריים בין Cys ל-Met, ניתן לחלק את כל המסלול הסינתטי לשלושה תהליכים…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים בתמיכה כספית מתוכנית המו”פ הלאומית של סין (2021YFC2103900); מענקי הקרן למדעי הטבע של סין (21778009, ו-21977010); הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג (2022A1515010996 ו- 2020A1515010521): ועדת החדשנות במדע וטכנולוגיה של שנזן, (RCJC20200714114433053, JCYJ201805081522131455, ו- JCYJ20200109140406047); ומענק מכון שנזן-הונג קונג למדעי המוח-שנזן למוסדות מחקר בסיסיים (2019SHIBS0004). המחברים מכירים בתמיכת כתבי העת של מדעי הכימיה , החברה המלכותית לכימיה לעיון 30 וכתב העת לכימיה אורגנית, האגודה האמריקאית לכימיה, לעיון 31.
Materials
| 1,3-bis(bromomethyl)-benzen | Energy | D0215 | |
| 1,3-Dimethylbarbituric acid | Energy | A46873 | |
| 1H NMR and HSQC | Bruker | AVANCE-III 400 | |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate | Energy | E020543 | |
| 2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) | Energy | A1797 | |
| 2-mercaptopyridine | Energy | Y31130 | |
| 6-Aminocaproic acid | Energy | A010678 | |
| Acetic anhydride | Energy | A01021454 | |
| Acetonitrile | Aldrich | 9758 | |
| Ammonium carbonate | Energy | 12980 | |
| Dichloromethane (DCM) | Energy | W330229 | |
| Digital Heating Cooling Drybath | Thermo Scientific | 88880029 | |
| Diisopropylethylamine (DIPEA) | Energy | W320014 | |
| Dimethyl formamide (DMF) | Energy | B020051 | |
| Dithiothreitol | Energy | A10027 | |
| Electrospray Ionization Mass | SHIMADZU2020 | LC-MS2020 | |
| Fmoc-Ala-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30101 | |
| Fmoc-Arg(Pbf)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30201 | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30501 | |
| Fmoc-Gln(Trt)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30601 | |
| Fmoc-Glu(OtBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30701 | |
| Fmoc-His(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30902 | |
| Fmoc-Ile-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31001 | |
| Fmoc-Lys(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31201 | |
| Fmoc-Met-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31301 | |
| Fmoc-Pro-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31501 | |
| Fmoc-Ser(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31601 | |
| Fmoc-Thr(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31701 | |
| Fmoc-Trp(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31801 | |
| Fmoc-Tyr(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31901 | |
| Fmoc-Val-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R32001 | |
| Formic acid | Energy | W810042 | |
| High Performance Liquid Chromatography |
SHIMADZU | LC-2030 | |
| Methanol | Aldrich | 9758 | |
| Morpholine | Aldrich | M109062 | |
| N,N'-Diisopropylcarbodiimide | Energy | B010023 | |
| Ninhydrin Reagent | Energy | N7285 | |
| Propargyl bromide | Energy | W320293 | |
| Rink Amide MBHA resin | Nanjing Peptide Biotech Ltd. | ||
| Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates | Thermo Scientific | 60300-403 | |
| Tetrakis(triphenylphosphine) palladium | Energy | T1350 | |
| Three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
| Triethylamine | Energy | B010737 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | J&K | 101398 | |
| Triisopropylsilane (TIS) | Energy | T1533 |
References
- Arkin, M. R., Tang, Y. Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: Progressing toward the reality. Chemistry Biology. 21 (9), 1102-1114 (2014).
- Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bis-alkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
- Muttenthaler, M., King, G. F., Adams, D. J., Alewood, P. F. Trends in peptide drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (4), 309-325 (2021).
- White, C. J., Yudin, A. K. Contemporary strategies for peptide macrocyclization. Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).
- Victoria, G. G., Reddy, S. R. Recent advances in the synthesis of organic chloramines and their insights into health care. New Journal of Chemistry. 45, 8386-8408 (2021).
- Kim, J. I., et al. Conformation and stereoselective reduction of hapten side chains in the antibody combining site. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9392-9394 (1991).
- Waddington, M. A., et al. An organometallic strategy for cysteine borylation. Journal of the American Chemical Society. 143 (23), 8661-8668 (2021).
- Luong, H. X., Bui, H. T. P., Tung, T. T. Application of the all-hydrocarbon stapling technique in the design of membrane-active peptides. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (4), 3026-3045 (2022).
- Góngora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
- Li, B., et al. Cooperative stapling of native peptides at lysine and tyrosine or arginine with formaldehyde. Angewandte Chemie International Edition. 60 (12), 6646-6652 (2021).
- Blaum, B. S., et al. Lysine and arginine side chains in glycosaminoglycan-protein complexes investigated by NMR, cross-Linking, and mass spectrometry: a case study of the factor h-heparin Interaction. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6374-6381 (2010).
- Petitdemange, R., et al. Selective tuning of elastin-like polypeptide properties via methionine oxidation. Biomacromolecules. 18 (2), 544-550 (2016).
- Kadlcik, V., et al. Reductive modification of a methionine residue in the amyloid-beta peptide. Angewandte Chemie International Edition. 45 (16), 259 (2006).
- Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).
- Reddy, C. B. R., et al. Antiviral activity of 3-(1-chloropiperidin-4-yl)-6-fluoro benzisoxazole 2 against white spot syndrome virus in freshwater crab, Paratelphusa hydrodomous. Aquaculture Research. 47 (8), 2677-2681 (2015).
- Embaby, A. M., Schoffelen, S., Kofoed, C., Meldal, M., Diness, F. Rational tuning of fluorobenzene probes for cysteine-selective protein modification. Angewandte Chemie International Edition. 57 (27), 8022-8026 (2018).
- Jiang, H. F., Chen, W. J., Wang, J., Zhang, R. S. Selective N-terminal modification of peptides and proteins: recent progresses and applications. Chinese Chemical Letters. 33 (1), 80-88 (2022).
- Yu, Y., et al. PDZ-reactive peptide activates ephrin-B reverse signaling and inhibits neuronal chemotaxis. ACS Chemical Biology. 11 (1), 149-158 (2016).
- Huhn, A. J., Guerra, R. M., Harvey, E. P., Bird, G. H., Walensky, L. D. Selective covalent targeting of anti-apoptotic BFL-1 by cysteine-reactive stapled peptide inhibitors. Cell Chemical Biology. 23 (9), 1123-1134 (2016).
- Chow, H. Y., Zhang, Y., Matheson, E., Li, X. C. Ligation technologies for the synthesis of cyclic peptides. Chemical Reviews. 119 (17), 9971-10001 (2019).
- Zhang, H. Y., Chen, S. Y. Cyclic peptide drugs approved in the last two decades (2001-2021). RSC Chemical Biology. 3 (1), 18-31 (2021).
- Lee, Y. J., Han, S. H., Lim, Y. B. Simultaneous stabilization and multimerization of a peptide alpha-helix by stapling polymerization. Macromolecular Rapid Communications. 37 (13), 1021-1026 (2016).
- Karthikeyan, K., et al. Anti-viral activity of methyl 1-chloro-7-methyl-2-propyl-1h-benzo[d] imidazole-5-carboxylate against white spot syndrome virus in freshwater crab (Paratelphusa hydrodromous). Aquaculture International. 30, 989-998 (2022).
- Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
- Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
- Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
- Kramer, J. R., Deming, T. J. Reversible chemoselective tagging and functionalization of methionine containing peptides. Chemical Communications. 49 (45), 5144-5146 (2013).
- Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bisalkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
- Merrifield, B. Solid phase synthesis. Nobel lecture, 8 December 1984. Bioscience Reports. 5 (5), 353-376 (1985).
- Wang, D. Y., et al. A sulfonium tethered peptide ligand rapidly and selectively modifies protein cysteine in vicinity. Chemical Science. 10 (19), 4966-4972 (2019).
- Hou, Z. F., et al. A sulfonium triggered thiol-yne reaction for cysteine modification. The Journal of Organic Chemistry. 85 (3), 1698-1705 (2020).
- Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).
