T 세포 백혈병에서 종양 유전자를 연구하기 위해 델타와 같은 4-발현 간질 세포에서 쥐 흉선세포의 공동 배양 및 형질도입

기술된 모든 동물 실험은 NIH 기관 생물안전 위원회(IBC) 및 동물 관리 및 사용 위원회(ACUC)에 의해 승인되었습니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 시약 및 재료와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 레트로바이러스 생산자 세포 배양 및 유지 관리 절차에 대한 자세한 내용은 게시된 지침19를 참조하십시오. 프로토콜에 대한 개요는 그림 1 을 참조하십시오. 1. OP9-DL4 세포의 배양 시작(Day 1) 바이알을 잡고 37°C의 수조에서 부드럽게 진탕하여 OP9-DL4 세포를 빠르게 해동합니다. 즉시 5mL의 OP9 배지(MEM-알파 배지, 10% FBS, 50U/mL 페니실린/스트렙토마이신, 55μM 2-메르캅토에탄올, 2mM L-글루타민)가 들어 있는 원심분리기 튜브로 세포를 옮겨 동결 방지제를 제거합니다. 실온에서 5분 동안 300× g 으로 원심분리합니다. 상청액을 버리고, 세포를 1 mL의 OP9 배지에 재현탁시킨다. 5mL의 OP9 배지를 T25 플라스크에 넣고 이 플라스크에 재현탁된 세포를 추가합니다. 37°C 및 5%CO2에서 배양한다. 2-3일 후, 1:3 분할을 사용하여 세포를 계대 배양합니다(매주 월요일, 수요일, 금요일에 세포 계대).참고: OP9-DL4 셀이 합류점에 도달하기 전에 분할합니다. OP9-DL4 플라스크는 흉선 세포와의 공동 배양을 위해 6-7일과 8-9+일에 80%-90% 합류해야 합니다. 따라서 OP9-DL4 셀을 분할하는 동안 해당 날짜에 필요한 OP9-DL4 셀의 수를 계획하는 것이 중요합니다.플라스크로부터 배지를 버리고, 단분자층을 1x PBS로 세척한다. PBS를 버리고 0.25% 트립신 1mL를 넣고 37°C에서 1-5분 동안 또는 세포가 플라스크에서 제거될 때까지 배양합니다. 플라스크를 두드려 세포를 제거합니다.참고: (선택 사항) 세포 해리의 진행 상황은 현미경으로 확인할 수 있습니다. 5mL의 OP9 배지를 추가하여 트립신을 비활성화하고, 재현탁 동안 플라스크의 세포로 덮인 표면을 헹구어 세포를 재현탁합니다. 실온에서 5분 동안 300× g 의 세포 현탁액을 원심분리하고 3mL의 OP9 배지에 재현탁합니다(1:3 분할의 경우). 1 mL의 세포 현탁액을 이미 5 mL의 신선한 OP9 배지가 들어있는 T25 플라스크에 넣는다. 나머지 셀을 고정/폐기합니다.OP9-DL4 세포를 동결시키기 위해, 1 mL의 동결 배지와 1 바이알의 비율로 90 % FBS / 10 % DMSO에서 세포를 재현탁한다. 향후 요구 사항에 따라 -80°C의 1mL 극저온 또는 액체 질소에서 동결합니다. 장기간 보관을 위해 액체 질소에 보관하십시오. 2. 레트로바이러스 생산자 세포주의 배양 시작(Day 1) 바이알을 잡고 37°C의 수조에서 부드럽게 진탕하여 레트로바이러스 생산자 세포주를 빠르게 해동합니다. 즉시 5mL의 레트로바이러스 생산자 세포 배지(RPC: DMEM, 10% FBS)가 들어 있는 원심분리기 튜브로 세포를 옮겨 동결방지제를 제거합니다. 실온에서 5분 동안 300× g 으로 원심분리합니다. 상청액을 버리고 1mL의 RPC 배지에 세포를 재현탁합니다. 5mL의 RPC 배지를 T25 플라스크에 넣고 재현탁된 세포를 이 플라스크에 추가합니다. 37°C 및 5%CO2에서 배양한다. 세포를 2-3일마다 1:5에서 1:8로 나누어 통과시킵니다.플라스크를 두드려 세포를 제거하고 공격적으로 피펫팅하여 세포를 다시 일시 중단합니다.참고: 이 세포는 트립신 없이 공격적인 피펫팅을 통해 플라스크 표면에서 제거할 수 있습니다. 또는 세포가 쉽게 분리될 때까지 트립신화(0.05% 트립신/0.53mM EDTA)하고 단일 세포 현탁액에 쉽게 피펫팅할 수 있습니다. 세포 현탁액을 300× g 에서 5분 동안 원심분리하고 5mL의 RPC 배지(1:5 분할용)에 재현탁합니다. 1mL의 세포 현탁액을 이미 5mL의 신선한 RPC 배지가 들어 있는 T25 플라스크에 넣습니다. 나머지 셀을 고정/폐기합니다. OP9-DL4 세포에 대해 설명된 것과 동일한 방식으로 레트로바이러스 생산자 세포를 동결합니다(단계 1.4.4.1–1.4.4.2). 3. 6웰 플레이트에서 레트로바이러스 생산자 세포의 배양 시작(4-5일) 2mL의 RPC 배지에서 6웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에서 70%-90% 밀도로 형질감염 18-24시간 전에 레트로바이러스 생산자 세포를 시딩하고 37°C 및 5%CO2에서 배양합니다.참고: 형질도입될 흉선 세포를 2-5 ×10 5 대 1 ×10 6 개의 흉선세포마다 레트로바이러스 생산자 세포의 두 웰을 형질감염시킵니다. 4. 관심 유전자를 포함하는 레트로바이러스를 생성하기 위해 레트로바이러스 생산자 세포를 형질감염시키기(5-6일) 트랜스펙션 1시간 전에 배지를 새 RPC 배지로 교체합니다. 리포펙션 혼합물 준비(6웰 플레이트의 각 웰에 대해 – 필요에 따라 스케일 업): 4μg의 DNA(헬퍼 플라스미드(pCL-Eco) 2μg 및 전달 플라스미드(pMIG) 2μg)를 환원 혈청 배지 250μL에 희석합니다. 부드럽게 섞는다. 10 μL의 형질주입 시약을 4.2 단계로부터의 환원된 혈청 배지 250 uL와 혼합한다. 실온에서 5분 동안 배양합니다. 5분 배양 후, 희석된 DNA를 희석된 형질주입 시약(총 부피 = 500μL)과 결합합니다. 부드럽게 섞고 실온에서 20-25 분 동안 배양하십시오. 500μL의 DNA/형질주입 시약 혼합물을 원형 운동으로 세포에 떨어뜨려 레트로바이러스 생산자 세포가 포함된 웰에 부드럽게 추가합니다. 플레이트를 앞뒤로 흔들어 부드럽게 혼합하고 37°C 인큐베이터에서 16-24시간 동안 배양합니다.참고: Subconfluent 세포(80%–90%)는 형질주입에 가장 적합하며 잠재적으로 가장 높은 바이러스 역가를 생성합니다. 레트로바이러스 생산자 세포는 플라스크에서 매우 쉽게 빠져나가므로 이러한 세포를 다룰 때 갑작스러운 움직임을 피하십시오. 5. 레트로바이러스 생산자 세포 배지 변경(6-7일) 형질주입 후 약 16시간 후에 기존 배지를 2mL의 새로운 RPC 배지로 교체합니다. 37°C에서 20-24시간 동안 세포를 계속 배양합니다. 형광 현미경으로 형질주입 효율을 평가합니다(선택 사항).참고: 이 프로토콜에서 GFP 양성 세포는 관심 있는 세포입니다( 그림 2 참조). 이 단계는 이 프로토콜에서 사용하기 위해 선택된 레트로바이러스 벡터(리포터 유전자가 골격에 존재하는지 여부)에 따라 달라집니다. 6. 흉선 세포 준비 및 CD4+ 및 CD8+ 세포 고갈(6-7일) 4-6주 된 C57BL/6 마우스에서 흉선을 채취합니다. 흉선 채취에 대한 자세한 내용은 Xing and Hogquist20을 참조하십시오.참고: 마우스는 CO2 흡입에 의해 안락사된 후 자궁경부 탈구되었습니다. 흉선을 페트리 접시에 PBS 5mL에 넣어 흉선 세포 단세포 현탁액을 준비합니다. 멸균 유리 슬라이드를 사용하여 슬라이드의 젖빛 표면 사이에 흉선을 놓고 슬라이드를 부드럽게 문질러 두 슬라이드 사이의 흉선을 굴립니다. 유리 슬라이드를 헹구어 세포를 모으고 남은 흉선 기질 조직을 버립니다.참고: 한 흉선에서 추정되는 수율은 106 6 세포 × 90 × 10 6-100 세포이며, 세포의 약 1%는 CD4 및 CD8 고갈 후에도 남아 있습니다. 출생 후 첫 주 동안 마우스 흉선의 세포질이 빠르게 증가하고 4-6 주령에 고원에 도달하고 이후 점진적으로 팽창하기 때문에 더 나은 세포 수율을 위해 어린 마우스의 흉선 조직을 사용하십시오21. 자동 혈구 계수기 또는 다른 방법을 사용하여 세포 수를 세십시오. 세포 여과기를 통해 흉선 현탁액 5mL를 피펫팅하여 흉선 현탁액을 30μm 또는 40μm 필터를 통해 흉선 현탁액을 여과합니다. 세포를 300 × g 에서 10 분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 제거하고, 1분 동안 튜브당 1mL의 완충액(샘플 크기에 따라 다름)을 첨가하여 ACK 용해 완충액으로 적혈구를 용해합니다. 5mL의 세포 고갈 완충액(500mL의 PBS[pH 7.2], 0.5% BSA, 2mM 0.5M EDTA, pH 8.0)을 추가하여 ACK 용해 완충액을 비활성화하고, 300× g 에서 10분 동안 원심분리하고, 계수를 위해 1-5mL의 세포 고갈 완충액에 다시 현탁합니다.참고: 고갈 전(고갈 전) 얼음 위에 다음을 따로 보관하십시오: 계수할 세포 현탁액 70μL(선택한 계수 세포 방법에 따라 다름) 및 세포 현탁액 200μL를 CD4 및 CD8에 대한 염색 및 유세포 분석으로 분석하여 고갈 효율을 결정합니다22,23. 세포를 계수하고, 300 × g 에서 10분 동안 원심분리한다. 세포 고갈 완충액의 1 × 107/80 μL에서 세포를 재현탁합니다. 1 × 107 세포 당 CD4 및 CD8 마이크로 비드 각각 10 μL를 첨가하십시오. 잘 섞고 냉장고(2–8 °C)의 어두운 곳에서 15분 동안 배양합니다. 2mL의 공핍 완충액으로 헹구고 플로우 스루를 폐기하여 공핍 컬럼을 준비합니다. 1 ×10 7 세포 당 1-2 mL의 고갈 완충액을 첨가하고 300 × g 에서 10 분 동안 원심 분리하여 6.6 단계에서 세포를 세척합니다. 상청액을 제거하고 폐기하십시오. 500μL의 공핍 완충액에서 최대 1.25 ×10 8 세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액을 컬럼에 적용하고, 플로우스루(표지되지 않은 세포)를 수집한다. 1mL의 완충액으로 컬럼을 2배 세척하고 플로우 스루를 수집합니다.참고: 컬럼 저장소가 비어 있는 경우에만 새 버퍼를 추가하십시오. 고갈 후 얼음 위에 다음을 따로 보관하십시오 (고갈 후 제어) : 70 μL의 세포 현탁액 (선택한 계수 세포 방법에 따라 다름) 및 1,000 μL의 세포 현탁액을 CD4 및 CD8에 대한 염색 및 유세포 분석으로 분석하여 고갈 효율을 결정합니다22,23. 고갈 전에 수집된 200μL의 세포를 4개의 FACS 튜브(염색되지 않은 샘플, CD4 단일 염색, CD8 단일 염색 및 CD4/CD8 이중 염색)로 분할하여 고갈 효율 제어를 염색합니다(염색되지 않은 샘플 및 단일 염색된 샘플을 사용하여 유세포 분석 파라미터 설정). 고갈 후 수집된 1,000μL의 세포를 사용하여 CD4 및 CD8을 염색하고 고갈 전에 수집된 이중 염색 샘플과 비교합니다( 그림 3의 일반적인 고갈 결과 참조).참고: 항체 제조업체의 권장 사항에 따라 유세포 분석 염색을 위한 부피를 조정합니다(예: 완충액 50μL에 1 x 106 개 세포당 항-CD4-FITC 1μL + 항-CD8-PE 0.5μL). 7. OP9-DL4 세포에서 흉선세포 배양(6-7일) 고갈 후 흉선세포를 2-5 ×10 5 대 1 × 10 6 사이토카인(10ng/mL 재조합 IL-7 및 재조합 hFLT-3)을 포함하는 OP9 배지의 80%-90% 융합 OP9-DL4 세포의 T25 플라스크에 넣습니다. 37°C 및 5%CO2에서 배양한다. OP9-DL4 세포에서 약 24시간 동안 성장합니다.참고: 이 지속 시간은 T 세포를 형질도입할 수 있도록 하는 데 필요합니다( 그림 4의 일반적인 결과 참조). 흉선세포와 OP9-DL4 세포의 공동배양물의 T25 플라스크 하나를 대조군(형질도입되지 않음)으로 사용할 수 있도록 예약한다. 형질도입되지 않은 흉선세포는 형질도입된 흉선세포(단계 9.1)와 함께 형질도입 효율을 평가하기 위한 음성 대조군으로 염색됩니다. 형질도입되지 않은 흉선세포는 또한 세포 분화에 대한 형질전환유전자 발현의 효과를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 사이토카인 함유 배지는 1개월 후에 폐기한다. 8. 상청액에서 레트로바이러스를 채취하여 흉선세포를 형질도입하는 데 사용(8-9일) 6웰 플레이트를 기울이고 플레이트 바닥에 3-5mL 주사기를 배치하고 플런저를 당겨 상층액을 흡인하여 형질주입된 세포에서 레트로바이러스를 포함하는 상층액을 수집합니다. 배지를 2mL의 새 RPC 배지로 교체합니다. 8.9단계에서 두 번째 형질도입을 위해 37°C에서 20-24시간 동안 세포를 계속 배양합니다. 0.45μm 주사기 필터를 통해 레트로바이러스 상청액을 여과하고 여과액을 50mL 튜브에 수집합니다.참고: 레트로바이러스 상청액을 동결하지 마십시오. 형질 도입을 위해 갓 만든 바이러스 제제를 사용하십시오. 플라스크 표면에서 흉선세포 및 OP9-DL4 세포를 제거하기 위해 공격적인 피펫팅에 의해 OP9-DL4 배양물로부터 흉선세포를 수집한다. 40μm 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 여과하여 대부분의 OP9-DL4 세포를 제거하고 여과액을 50mL 튜브에 수집합니다.참고: OP9 셀은 매우 접착력이 있습니다. 공격적인 피펫팅이 플라스크에서 OP9-DL4 세포의 일부를 제거할 수 있지만, 이 과정에서 OP9-DL4 단층의 파괴는 최소화되며, OP9-DL4 세포가 1차 흉선 세포보다 훨씬 크기 때문에 떨어져 나온 OP9-DL4 세포는 40μm 세포 스트레이너로 걸러집니다. OP9-DL4 세포가 여전히 80%-90% 합류하면 흉선 세포를 제거하고 동일한 OP9-DL4 플라스크에 다시 플레이팅합니다. 또는 새로운 OP9-DL4 플라스크를 준비해야 합니다. 단계 8.3의 여액에서 흉선 세포를 300 × g 에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 상청액을 버리십시오. 50mL 튜브에서 흉선세포를 0.5-1mL의 OP9 배지 + 사이토카인에 재현탁합니다(7.1단계 참조). 바이러스가 포함된 RPC 배지 1-2mL를 추가합니다(흉선 세포 배지의 두 배의 RPC 배지). 헥사메트린 브로마이드(10μg/μL 스톡 농도)를 첨가하여 8μg의 헥사메트린 브로마이드/mL의 총 세포 현탁액을 생성합니다. 실온에서 1시간 동안 850 × g 에서 세포를 원심분리하여 스피노큘레이트한다. 플라스크 당 6 mL의 OP9 배지 + 사이토카인에 세포를 재현탁시키고(단계 7.1 참조), 현탁액을 OP9-DL4 세포 단층 상에 다시 첨가한다.참고: 또는 형질도입된 흉선 세포를 받을 수 있도록 새 OP9-DL4 플라스크를 준비하십시오. 흉선 세포를 사용한 OP9-DL4 플라스크에 다시 넣어야 하는 경우 흉선 세포 분주 1시간 동안 OP9-DL4 세포에 신선한 OP9 배지를 추가하여 세포를 건강하게 유지하고 80%-90% 밀도를 보장해야 합니다. 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 레트로바이러스 함유 세포 상청액의 새 웰을 사용하여 8.2–8.7단계를 반복합니다. 9. 형질도입된 흉선세포를 OP9-DL4 배양액에 2-5일 동안 유지하거나 필요에 따라 동결(Day 9+) CD4, CD8, CD25 및 CD44와 같은 T 세포 발달 마커에 대한 흉선 세포를 염색하여 유세포 분석에 의한 흉선 세포 분화를 평가합니다23. 그림 5에서 일반적인 흉선 세포 분화 결과를 참조하십시오.