Bu protokol, yetişkin insan korteksinin uzun süreli organotipik kültürlerini, indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı kortikal progenitörlerin ex vivo intrakortikal transplantasyonu ile birlikte tanımlamakta ve insan nörodejeneratif bozuklukları için kök hücre bazlı tedavileri daha fazla test etmek için yeni bir metodoloji sunmaktadır.
Nörodejeneratif bozukluklar, semptomları ve hücresel etkileri açısından yaygın ve heterojendir, bu da insan hastalıklarını tamamen taklit eden uygun hayvan modellerinin bulunmaması ve ölüm sonrası insan beyin dokusunun zayıf mevcudiyeti nedeniyle çalışmalarını karmaşık hale getirmektedir. Yetişkin insan sinir dokusu kültürü, nörolojik bozuklukların farklı yönlerini inceleme imkanı sunar. Moleküler, hücresel ve biyokimyasal mekanizmalar bu sistemde kolayca ele alınabilir, ayrıca ilaçları veya hücre bazlı tedaviler gibi farklı tedavileri test edebilir ve doğrulayabilir. Bu yöntem, rezeksiyonel cerrahi geçiren epileptik hastalardan elde edilen yetişkin insan korteksinin uzun süreli organotipik kültürlerini ve indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı kortikal progenitörlerin ex vivo intrakortikal transplantasyonunu birleştirir. Bu yöntem, hücre sağkalımı, nöronal farklılaşma, sinaptik girdi ve çıkışların oluşumu ve bozulmamış yetişkin insan kortikal dokusuna transplantasyondan sonra insan kaynaklı hücrelerin elektrofizyolojik özelliklerinin incelenmesine izin verecektir. Bu yaklaşım, temel araştırmayı farklı nörolojik bozuklukları olan hastalar için kök hücre tabanlı tedavilerin klinik çevirisine yaklaştıracak ve hasarlı sinir devrelerini yeniden yapılandırmak için yeni araçların geliştirilmesine izin verecek bir 3D insan hastalığı modelleme platformunun geliştirilmesinden önce önemli bir adımdır.
Parkinson hastalığı, Alzheimer hastalığı veya iskemik inme gibi nörodejeneratif bozukluklar, nöronal fonksiyon bozukluğu veya ölümün ortak özelliğini paylaşan bir grup hastalıktır. Etkilenen beyin bölgesi ve nöronal popülasyon açısından heterojendirler. Ne yazık ki, bu hastalıkların tedavileri, insan beyninde meydana gelenleri taklit eden hayvan modellerinin eksikliği nedeniyle kıttır veya sınırlı etkinliğe sahiptir 1,2. Kök hücre tedavisi, beyin yenilenmesi için en umut verici stratejilerden biridir3. Farklı kaynaklardan gelen kök hücrelerden nöronal progenitörlerin üretimi son yıllarda büyük ölçüde gelişmiştir 4,5. Son yayınlar, insan kaynaklı pluripotent kök (iPS) hücre kaynaklı uzun süreli kendini yenileyen nöroepitel benzeri kök (lt-NES) hücrelerinin, kortikal bir farklılaşma protokolünü takiben ve somatosensoriyel korteksi etkileyen iskemik inme ile bir sıçan modelinde intrakortikal transplantasyondan sonra, olgun kortikal nöronlar ürettiğini göstermiştir. Ek olarak, greft kaynaklı nöronlar, konakçı nöronlardan afferent ve efferent sinaptik bağlantılar aldı ve sıçan nöronal ağına entegrasyonlarını gösterdi 6,7. Greft kaynaklı aksonlar miyelinize edildi ve peri-enfarkt alanı, korpus kallozum ve kontralateral somatosensoriyel korteks dahil olmak üzere sıçan beyninin farklı bölgelerinde bulundu. En önemlisi, iPS hücre kaynaklı transplantasyon, inme hayvanlarında motor açıklarını tersine çevirdi7.
Hayvan modelleri, nakil sağkalımını, nöronal entegrasyonu ve aşılanmış hücrelerin motor ve bilişsel işlevler üzerindeki etkisini incelemeye yardımcı olsa bile, insan hücreleri (greft-konakçı) arasındaki etkileşim hakkında bilgi bu sistemde eksiktir 8,9. Bu nedenle, uzun süreli insan beyni organotipik kültürünün, insan iPS hücresi kaynaklı nöronal progenitörlerin ex vivo transplantasyonu ile kombine bir yöntemi burada tanımlanmıştır. Nöroşirürji rezeksiyonlarından elde edilen insan beyni organotipik kültürleri, araştırmacıların insan merkezi sinir sistemi devresi ve insan beyin bozuklukları için tedavileri test etmenin en doğru yolu hakkındaki anlayışlarını arttırmalarını sağlayan fizyolojik olarak ilgili 3D beyin modelleridir. Bununla birlikte, bu bağlamda yeterli araştırma yapılmamıştır ve çoğu durumda, insan hipokampal beyin organotipik kültürleri kullanılmıştır10,11. Serebral korteks, iskemik inme12 veya Alzheimer hastalığı13 gibi çeşitli nörodejeneratif bozukluklardan etkilenir, bu nedenle bilgimizi genişletmemize ve farklı terapötik stratejileri test etmemize ve doğrulamamıza izin veren bir insan kortikal 3D sistemine sahip olmak önemlidir. Son birkaç yılda yapılan birçok çalışma, insan beyin hastalıklarını modellemek için yetişkin insan kortikal (hACtx) dokusundan kültürleri kullanmıştır 14,15,16,17,18,19; ancak kök hücre tedavisi bağlamında sınırlı bilgi mevcuttur. İki çalışma, burada açıklanan sistemin fizibilitesini zaten göstermiştir. 2018 yılında, farklı transkripsiyon faktörleriyle programlanan ve hACtx dokusuna nakledilen insan embriyonik kök hücrelerinin, yetişkin insan kortikal ağlarına entegre olabilen olgun kortikal nöronlara yol açtığı gösterilmiştir20. 2020 yılında, lt-NES hücrelerinin insan organotipik sistemine transplantasyonu, fonksiyonel nöronların elektrofizyolojik özellikleri ile olgun, tabakaya özgü kortikal nöronlara farklılaşma kapasitelerini ortaya koydu. Aşılanmış nöronlar, kuduz virüsü retrograd monosinaptik izleme, tüm hücre yama-kelepçe kayıtları ve immüno-elektron mikroskobu21 ile doğrulandığı gibi, yetişkin beyin dilimlerindeki insan kortikal nöronları ile hem afferent hem de efferent sinaptik temaslar kurdu.
Yeterince yüksek kalitede hACtx dilimleri elde etmek, bu protokoldeki en kritik adımdır. Rezeksiyon cerrahisi uygulanan epileptik hastalardan kortikal doku elde edilir24. Rezeke edilen dokunun kalitesi ve rezeksiyon ile kültür arasındaki dokunun maruz kalma süresi kritiktir; doku ameliyathaneden laboratuvara ne kadar hızlı aktarılır ve kesilirse, organotipik kültür o kadar optimal olur. İdeal olarak, doku kesilmeli ve toplandıktan sonraki ilk birkaç saat içinde h…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, İsveç Araştırma Konseyi, İsveç Beyin Vakfı, İsveç İnme Vakfı, Bölge Skåne, Thorsten ve Elsa Segerfalk Vakfı ve İsveç Hükümeti Stratejik Araştırma Alanları Girişimi (StemTherapy) tarafından desteklenmektedir.
Tissue Cutting and electrophysiology | |||
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
Bath temperature controller | Luigs & Neumann | TC0511354 | |
Calcium Chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
Carbogen gas | Air Liquide | NA | |
Cooler | Julaba FL 300 | 9661012.03 | |
D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
Double Patch-Clamp amplifier | HEKA electronic | EPC10 | |
Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt | Millipore | 371701 | |
HEPES | AppliChem | A1069 | |
Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
Patchmaster | HEKA electronic | Patchmaster 2×91 | |
Pipette Puller | Sutter | P-2000 | |
Plastic Petri dish | Any suitable | ||
Potassium chloride | Merck | 104936 | |
Potassium D-gluconate | ThermoFisher | B25135 | |
Rubber teat + glass pipette | Any suitable | ||
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Tissue adhesive: Acryl super glue | Loctite | 2062278 | |
Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
Vibratome | Leica | VT1200 S | |
RINSING SOLUTION | |||
D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
HEPES | AppliChem | A1069 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE | |||
6-well plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
Alvetex scaffold 6 well insert | Reinnervate Ltd | AVP004-96 | |
B27 Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | |
BrainPhys without Phenol Red | StemCell technologies | #05791 | Referenced as neuronal medium in the text |
Filter units 250 mL or 500 mL | Corning Sigma | CLS431096/97 | |
Forceps | Any suitable | ||
Gentamicin (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | |
Glutamax Supplement (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Referenced as L-glutamine in the text |
Rubber teat + Glass pipette | Any suitable | ||
GENERATION OF lt-NES cells | |||
2-Mercaptoethanol 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
Animal Free Recombinant EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
B27 Suplemment (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | ThermoFisher Scientific | 15260037 | |
Cyclopamine, V. calcifornicum | Calbiochem | # 239803 | |
D (+) Glucose solution (45%) | Sigma | G8769 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2438-10mL | |
DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | |
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | Without calcium and magnesium |
Laminin Mouse Protein, Natural | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
MEM Non-essential aminoacids solutions (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
N-2 Supplement (100 x) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | |
Poly-L-Ornithine | Merk | P3655 | |
Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP-010 | |
Recombinant Human Wnt-3a Protein | R&D Systems | 5036-WN | |
Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
Soybean Trypsin Inhibitor, powder | Thermo Fisher Scientific | 17075029 | |
Sterile deionized water | MilliQ | MilliQ filter system | |
Trypsin EDTA (0.25%) | Sigma | T4049-500ML | |
EQUIPMENT FOR CELL CULTURE | |||
Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL | Eppendorf | Various | |
Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel) | Corning | CLS354277-1EA | |
Centrifuge | Hettich Centrifugen | Rotina 420R | 5% CO2, 37 °C |
Incubator | ThermoForma Steri-Cult CO2 | HEPA Class100 | |
Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm | Vitrolife | 14601 | |
Sterile tubes | Sarstedt | Various | |
Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm | VWR | 612-1701 | |
Sterile pipette tips 0.1-1000 µL | Biotix VWR | Various | |
Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL | Costar | Various | |
T25 flasks Nunc | ThermoFisher Scientific | 156367 | |
IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-545-151 | |
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoReserach | 711-545-152 | |
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-545-155 | |
Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin | Jackson ImmunoReserach | 016-600-084 | |
Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoReserach | 001-000-162 | |
Chicken anti-GFP | Merk Millipore | AB16901 | |
Chicken anti-MAP2 | Abcam | ab5392 | |
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-165-155 | |
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG | Jackson ImmunoReserach | 705-165-147 | |
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-165-151 | |
Diazabicyclooctane (DABCO) | Sigma Aldrich | D27802 | Mounting media |
Goat anti-AIF1 (C-terminal) | Biorad | AHP2024 | |
Hoechst 33342 | Molecular Probes | Nuclear staining | |
Mouse anti-MBP | BioLegend | 808402 | |
Mouse anti-SC123 | Stem Cells Inc | AB-123-U-050 | |
Normal Donkey Serum | Merk Millipore | S30-100 | |
Paint brush | Any suitable | ||
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | 150127 | |
Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x) | |||
Distilled water | |||
Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4) | Merk Millipore | 104873 | |
Potassium phospate dibasic (K2HPO4) | Sigma Aldrich | P3786 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S3014 | |
Rabbit anti-NeuN | Abcam | ab104225 | |
Rabbit anti-Olig2 | Abcam | ab109186 | |
Rabbit anti-TMEM119 | Abcam | ab185333 | |
Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
Sodium citrate | |||
Distilled water | |||
Tri-Sodium Citrate | Sigma Aldrich | S1804-500G | |
Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
Triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 327371000 | |
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
Confocal microscope | Zeiss | LSM 780 | |
Microscope Slides 76 mm x 26 mm | VWR | 630-1985 | |
Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 107242 | |
Microscope Software | Zeiss | ZEN Black edition | |
Rubber teat + Glass pipette | Any suitable |