חקירת שיתוף פעולה מיקרוביאלי באמצעות ניתוח ספקטרומטריית מסות הדמיה של מושבות חיידקים הגדלות על אגר וברקמות במהלך זיהום

המיקרוביום האנושי הוא מערכת אקולוגית דינמית ביותר הכוללת אינטראקציות מולקולריות של חיידקים, נגיפים, ארכאה ואיקריוטים מיקרוביאליים אחרים. בעוד שיחסים מיקרוביאליים נחקרו באינטנסיביות בשנים האחרונות, עדיין ניתן להבין הרבה על תהליכים מיקרוביאליים ברמה הכימית ^1,2. זה נובע בחלקו מחוסר הזמינות של כלים המסוגלים למדוד במדויק סביבות מיקרוביאליות מורכבות. ההתקדמות בתחום ספקטרומטריית מסות הדמיה (IMS) בעשור האחרון אפשרה מיפוי מרחבי באתרו וללא תוויות של מטבוליטים, שומנים וחלבונים רבים במצעים ביולוגיים ^3,4. ספיחה/יינון לייזר בסיוע מטריצה (MALDI) התפתחה כטכניקת היינון הנפוצה ביותר המשמשת בספקטרומטריית מסות הדמיה, הכוללת שימוש בלייזר UV כדי לעבד חומר מפני השטח של קטע רקמה דק למדידה על ידי ספקטרומטריית מסה⁴. תהליך זה מתאפשר על ידי יישום מטריצה כימית המיושמת באופן הומוגני על פני השטח של הדגימה, ומאפשרת לבצע מדידות רציפות בתבנית רסטר על פני שטח הדגימה. מפות חום של עוצמות יונים אנליטיות נוצרות לאחר מכן לאחר איסוף נתונים. ההתקדמות האחרונה במקורות יינון וטכניקות דגימה אפשרה ניתוח של מצעים לא מסורתיים כגון חיידקים⁵ ויונקים ^6,7,8 דגימות תאיות שגדלו על אגר מזין. המידע המולקולרי המרחבי המסופק על ידי IMS יכול לספק תובנה ייחודית לגבי התקשורת הביוכימית של אינטראקציות מיקרוב-מיקרוב ומיקרובים מארחים במהלך זיהום 9,10,11,12,13,14.

עם זיהום Clostridioides difficile (CDI), C. difficile נחשף לסביבה מיקרוביאלית המשתנה במהירות במערכת העיכול, שבה אינטראקציות מיקרוביאליות צפויות להשפיע על תוצאות זיהום^15,16. באופן מפתיע, מעט ידוע על המנגנונים המולקולריים של אינטראקציות בין C. difficile לבין מיקרוביוטה תושב במהלך זיהום. לדוגמה, אנטרוקוקים הם קבוצה של פתוגנים אופורטוניסטיים במיקרוביום המעי ונקשרו לרגישות מוגברת ולחומרה של CDI^17,18,19,20. עם זאת, מעט ידוע על המנגנונים המולקולריים של האינטראקציות בין פתוגנים אלה. כדי להמחיש תקשורת של מולקולות קטנות בין החברים האלה במיקרוביום המעי, מקרו-מושבות חיידקים גודלו כאן על אגר כדי לדמות אינטראקציות מיקרואורגניזם והיווצרות ביופילם חיידקי בסביבה מבוקרת. עם זאת, השגת התפלגות מטבולית מייצגת בניתוח ספקטרומטריית מסה של הדמיית MALDI של דגימות תרבית חיידקים היא מאתגרת בשל תכולת המים הגבוהה וטופוגרפיית פני השטח הלא אחידה של דגימות אלה. זה נגרם בעיקר על ידי האופי ההידרופילי מאוד של אגר ואת התגובה משטח אגר לא אחיד במהלך הסרת לחות.

תכולת המים הגבוהה של אגר יכולה גם להקשות על השגת ציפוי מטריצת MALDI הומוגני ויכולה להפריע לניתוח MALDI הבא שבוצע ב- vacuo²¹. לדוגמה, מקורות MALDI רבים פועלים בלחצים של 0.1-10 Torr, שהוא ואקום מספיק כדי להסיר לחות מהאגר ויכול לגרום לעיוות של הדגימה. שינויים מורפולוגיים אלה באגר הנגרמים על ידי סביבת הוואקום גורמים לבעבוע וסדקים בחומר האגר המיובש. ממצאים אלה מפחיתים את ההיצמדות של האגר למגלשה ויכולים לגרום לפירוק או התקלפות של הדגימה לתוך מערכת ואקום המכשיר. עובי דגימות האגר יכול להיות עד 5 מ”מ מהמגלשה, מה שעלול ליצור מרווח לא מספיק מאופטיקת היונים בתוך המכשיר, ולגרום לזיהום ו/או נזק לאופטיקה של יונים במכשיר. השפעות מצטברות אלה יכולות לגרום להפחתה של אות היונים המשקף את טופוגרפיית פני השטח, במקום את האינטראקציות הביוכימיות המיקרוביאליות הבסיסיות. דגימות אגר חייבות להיות מיובשות בצורה הומוגנית ולהיות מודבקות בחוזקה לשקופית מיקרוסקופ לפני ניתוח בחלל ריק.

מאמר זה מדגים תהליך הכנה לדוגמה לייבוש מבוקר של מושבות מאקרו בתרבית חיידקים הגדלות על מצע אגר. תהליך ייבוש רב שלבי ואיטי זה (יחסית לאלה שדווחו בעבר) מבטיח כי האגר יתייבש באופן אחיד תוך מזעור ההשפעות של בעבוע או פיצוח של דגימות אגר המותקנות על שקופיות מיקרוסקופ. על ידי שימוש בשיטת ייבוש הדרגתית זו, הדגימות נצמדות מאוד לשקופית המיקרוסקופ וניתנות ליישום מטריצה עוקב ולניתוח MALDI. הדבר מודגם באמצעות מושבות חיידקים מודל של C. difficile הגדלות על מודלים של רקמת אגר ומורין המכילות CDI עם וללא נוכחות של פתוגן קומנסלי ואופורטוניסטי, Enterococcus faecalis. ניתוח ספקטרומטריית מסה של MALDI של מודלים חיידקיים ורקמתיים מאפשר מיפוי מרחבי של פרופילי מטבוליטים של חומצות אמינו, ומספק תובנה חדשה לגבי מטבוליזם מיקרוביאלי ביו-אנרגטי ותקשורת.