Raccolta dati Cryo-EM a singola particella con inclinazione dello stadio utilizzando Leginon

L’avvento dei rivelatori di elettroni diretti nell’ultimo decennio 1,2,3 ha stimolato un aumento esponenziale del numero di strutture ad alta risoluzione di macromolecole e assemblaggi macromolecolari risolti utilizzando crio-EM ^4,5,6 a singola particella. Ci si aspetta che quasi tutte le specie macromolecolari purificate siano suscettibili di determinazione della struttura utilizzando la crio-EM, ad eccezione delle proteine più piccole di dimensioni ~ 10 kDa o inferiori a⁷. La quantità di materiale di partenza necessaria per la preparazione della griglia e la determinazione della struttura è almeno un ordine di grandezza inferiore rispetto ad altre tecniche di determinazione della struttura, come la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare e la cristallografia a raggi X ^4,5,6.

Tuttavia, una delle principali sfide per la determinazione della struttura da parte della crio-EM riguarda un’adeguata preparazione della griglia per l’imaging. Uno studio approfondito che ha valutato diversi campioni utilizzando diverse strategie e griglie di vetrificazione ha suggerito che la maggior parte degli approcci per la vetrificazione dei campioni su griglie crio-EM porta ad un’aderenza preferenziale delle macromolecole all’interfaccia aria-acqua⁸. Tale aderenza può potenzialmente causare quattro risultati subottimali: (1) il campione macromolecolare si denatura completamente, nel qual caso non è possibile una raccolta e un’elaborazione dei dati di successo; (2) il campione si denatura parzialmente, nel qual caso può essere possibile ottenere informazioni strutturali da regioni della macromolecola che non sono danneggiate; (3) il campione mantiene la struttura nativa, ma solo una serie di orientamenti delle particelle rispetto alla direzione del fascio di elettroni sono rappresentati nelle immagini; (4) Il campione mantiene la struttura nativa, e alcuni ma non tutti i possibili orientamenti delle particelle rispetto alla direzione del fascio di elettroni sono rappresentati nelle immagini. Per i casi (3) e (4), la raccolta di dati inclinata aiuterà a ridurre al minimo l’anisotropia della risoluzione direzionale che influisce sulla mappa crio-EM ricostruita e fornisce una soluzione generalizzabile per un’ampia varietà di campioni⁹. Tecnicamente, l’inclinazione può anche avvantaggiare il caso (2), poiché la denaturazione si verifica presumibilmente all’interfaccia aria-acqua e limita allo stesso modo il numero di orientamenti distinti rappresentati all’interno dei dati. L’estensione della distorsione dell’orientamento nel set di dati può potenzialmente essere alterata sperimentando additivi per soluzioni, ma la mancanza di un’ampia applicabilità ostacola questi approcci di prova ed errore. L’inclinazione dello stadio del campione con un singolo angolo di inclinazione ottimizzato è sufficiente per migliorare la distribuzione degli orientamenti in virtù dell’alterazione della geometria dell’esperimento di imaging⁹ (Figura 1). A causa della configurazione geometrica del campione orientato preferenzialmente rispetto al fascio di elettroni, per ogni gruppo di orientamenti preferenziali, l’inclinazione della griglia genera un cono di angoli di illuminazione rispetto al centroide del cluster. Quindi, questo diffonde le viste e di conseguenza migliora il campionamento dello spazio di Fourier e l’isotropia della risoluzione direzionale.

Ci sono, in pratica, alcuni svantaggi nell’inclinare il palcoscenico. L’inclinazione dello stadio del campione introduce un gradiente di messa a fuoco attraverso il campo visivo, che può influire sull’accuratezza delle stime della funzione di trasferimento del contrasto (CTF). La raccolta di dati inclinati può anche portare a un aumento del movimento delle particelle indotto dal fascio causato da maggiori effetti di carica durante l’imaging di campioni inclinati. L’inclinazione della griglia porta anche ad un aumento dello spessore apparente del ghiaccio, che a sua volta porta a micrografie più rumorose e può in definitiva influire sulla risoluzione delle ricostruzioni 5,9,10. Potrebbe essere possibile superare questi problemi applicando schemi avanzati di elaborazione dei dati computazionali che sono brevemente descritti nelle sezioni protocollo e discussione. Infine, l’inclinazione può portare a una maggiore sovrapposizione delle particelle, ostacolando la successiva pipeline di elaborazione delle immagini. Sebbene questo possa essere mitigato in una certa misura ottimizzando la concentrazione di particelle sulla griglia, è comunque una considerazione importante. Qui viene descritto un protocollo semplice da implementare per la raccolta di dati inclinati utilizzando la suite software Leginon (un software di acquisizione automatica delle immagini), accessibile ad accesso aperto e compatibile con un’ampia gamma di microscopi^11,12,13,14. Il metodo richiede almeno la versione 3.0 o successiva, con le versioni dalla 3.3 in poi contenenti miglioramenti dedicati per consentire la raccolta dei dati inclinata. Non è necessario alcun software o apparecchiatura aggiuntiva per questo protocollo. Istruzioni dettagliate sull’infrastruttura computazionale e sulle guide all’installazione sono fornite altrove¹⁵.