איסוף נתוני Cryo-EM של חלקיק יחיד עם הטיית במה באמצעות Leginon

הופעתם של גלאי אלקטרונים ישירים במהלך העשור האחרון ^1,2,3 דרבנה עלייה אקספוננציאלית במספר מבנים ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולות ומכלולים מקרומולקולריים שנפתרו באמצעות קריו-EM 4,5,6 של חלקיק יחיד. כמעט כל המינים המקרומולקולריים המטוהרים צפויים להיות מקובלים לקביעת מבנה באמצעות cryo-EM, למעט החלבונים הקטנים ביותר ~ 10 kDa בגודל או מתחת ל –⁷. כמות חומר המוצא הדרושה להכנת רשת ולקביעת מבנה היא לפחות בסדר גודל קטן יותר מטכניקות אחרות לקביעת מבנה, כגון ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית וקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ^4,5,6.

עם זאת, אתגר עיקרי לקביעת מבנה על ידי cryo-EM כרוך בהכנת רשת מתאימה להדמיה. מחקר מקיף שהעריך דגימות מגוונות באמצעות אסטרטגיות ויטריפיקציה ורשתות שונות הציע כי רוב הגישות לדגימות ויטריפיקציה ברשתות cryo-EM מובילות להיצמדות מועדפת של מקרומולקולות לממשק אוויר-מים⁸. היצמדות כזו עלולה לגרום לארבע תוצאות תת-אופטימליות: (1) הדגימה המקרומולקולרית מתפרקת לחלוטין, ובמקרה כזה לא ניתן לאסוף ולעבד נתונים מוצלחים; (2) הדגימה מנטרלת חלקית, ובמקרה כזה ניתן יהיה לקבל תובנות מבניות מאזורים במקרומולקולה שאינם פגומים; (3) הדגימה שומרת על מבנה מקורי, אך רק קבוצה אחת של כיווני חלקיקים ביחס לכיוון קרן האלקטרונים מיוצגת בתמונות; (4) הדגימה שומרת על מבנה מקורי, וחלק מכיווני החלקיקים האפשריים, אם כי לא כולם, ביחס לכיוון קרן האלקטרונים מיוצגים בתמונות. במקרים (3) ו-(4), איסוף נתונים מוטים יסייע במזעור אנאיזוטרופיה ברזולוציה כיוונית המשפיעה על מפת cryo-EM המשוחזרת ומספק פתרון הניתן להכללה למגוון רחב של דגימות⁹. מבחינה טכנית, הטיה יכולה להועיל גם במקרה (2), מכיוון שהדנטורציה מתרחשת ככל הנראה בממשק אוויר-מים ומגבילה באופן דומה את מספר הכיוונים השונים המיוצגים בתוך הנתונים. ניתן לשנות את מידת הטיית ההתמצאות במערך הנתונים באופן פוטנציאלי על ידי ניסויים בתוספי תמיסה, אך היעדר ישימות רחבה מעכב גישות אלה של ניסוי וטעייה. די בהטיית שלב הדגימה בזווית הטיה אופטימלית אחת כדי לשפר את התפלגות הכיוונים הודות לשינוי הגיאומטריה של ניסוי ההדמיה⁹ (איור 1). בשל התצורה הגיאומטרית של המדגם המכוון המועדף ביחס לקרן האלקטרונים, עבור כל צביר של כיוונים מועדפים, הטיית הרשת יוצרת חרוט של זוויות הארה ביחס לצביר. לפיכך, זה מפזר את התצוגות וכתוצאה מכך משפר את דגימת מרחב פורייה ואת האיזוטרופיה של רזולוציה כיוונית.

יש, בפועל, כמה נזקים להטיית הבמה. הטיית שלב הדגימה מציגה מעבר צבע מיקוד על פני שדה הראייה, שעשוי להשפיע על דיוק הערכות פונקציית העברת הניגודיות (CTF). איסוף נתונים מוטים עשוי גם להוביל לתנועת חלקיקים מוגברת הנגרמת על ידי אלומה הנגרמת על ידי השפעות טעינה מוגברות בעת הדמיה של דגימות מוטות. הטיית הרשת מובילה גם לעלייה בעובי הקרח הנראה לעין, מה שבתורו מוביל למיקרוגרפים רועשים יותר ועשוי בסופו של דבר להשפיע על הרזולוציה של שחזורים 5,9,10. ייתכן שניתן יהיה להתגבר על בעיות אלה על ידי יישום סכמות עיבוד נתונים חישוביות מתקדמות המתוארות בקצרה בסעיפי הפרוטוקול והדיון. לבסוף, הטיה יכולה להוביל לחפיפה מוגברת של חלקיקים, ולעכב את צינור עיבוד התמונה הבא. למרות שניתן למתן זאת במידה מסוימת על ידי אופטימיזציה של ריכוז החלקיקים ברשת, זהו בכל זאת שיקול חשוב. כאן, מתואר פרוטוקול פשוט ליישום לאיסוף נתונים מוטים באמצעות חבילת התוכנה Leginon (תוכנה אוטומטית לרכישת תמונות), זמין בגישה פתוחה ותואם למגוון רחב של מיקרוסקופים^11,12,13,14. השיטה דורשת לפחות גרסה 3.0 ומעלה, כאשר גרסאות 3.3 ואילך מכילות שיפורים ייעודיים כדי לאפשר איסוף נתונים מוטה. אין צורך בתוכנה או ציוד נוספים עבור פרוטוקול זה. הוראות נרחבות בנושא תשתיות חישוביות ומדריכי התקנה ניתנים במקום אחר¹⁵.