Bu yazıda, ara yüz morfolojisini görselleştirirken ara yüz gerilimi ve yüzey dilatasyonel reolojisinin eşzamanlı ölçümlerini yapmak için bir mikrotensiyometre/konfokal mikroskobun tasarımı ve çalışması anlatılmaktadır. Bu, teknoloji ve fizyolojide önemli olan arayüzlerin yapı-özellik ilişkilerinin gerçek zamanlı olarak inşasını sağlar.
Yüzey-aktif moleküllerin sıvı-sıvı arayüzlerine adsorpsiyonu doğada her yerde bulunur. Bu arayüzlerin karakterize edilmesi, yüzey aktif madde adsorpsiyon oranlarının ölçülmesini, denge yüzey gerilimlerinin toplu yüzey aktif madde konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak değerlendirilmesini ve yüzey geriliminin dengeyi takiben ara yüzey alanındaki değişikliklerle nasıl değiştiğini ilişkilendirmeyi gerektirir. Yüksek hızlı konfokal mikroskopla floresan görüntüleme kullanılarak arayüzün eşzamanlı olarak görselleştirilmesi, yapı-fonksiyon ilişkilerinin doğrudan değerlendirilmesini sağlar. Kılcal basınç mikrotensiyometresinde (CPM), kılcal damarın ucunda 1 mL hacimli bir sıvı haznesinde yarım küre şeklinde bir hava kabarcığı sabitlenir. Kabarcık arayüzü boyunca kılcal basınç, Laplace denklemine dayalı model tabanlı basınç, kabarcık eğriliği veya kabarcık alanı kontrolüne izin veren ticari bir mikroakışkan akış kontrolörü aracılığıyla kontrol edilir. Langmuir oluğu ve kolye damlası gibi önceki tekniklerle karşılaştırıldığında, ölçüm ve kontrol hassasiyeti ve tepki süresi büyük ölçüde geliştirilmiştir; kılcal basınç değişimleri milisaniyeler içinde uygulanabilir ve kontrol edilebilir. Kabarcık arayüzünün dinamik tepkisi, kabarcık genişledikçe ve büzüldükçe ikinci bir optik lens aracılığıyla görselleştirilir. Kabarcık konturu, kabarcık eğriliği yarıçapını, R’yi ve sonuçları geçersiz kılacak dairesellikten sapmaları belirlemek için dairesel bir profile uygundur. Laplace denklemi, arayüzün dinamik yüzey gerilimini belirlemek için kullanılır. Dengeyi takiben, dilatasyon modülünü belirlemek için kabarcık yarıçapını (0.001-100 döngü / dak frekansları) salınımına sokmak için bilgisayar kontrollü mikroakışkan pompa tarafından küçük basınç salınımları uygulanabilir Sistemin genel boyutları, mikrotensiyometrenin yüksek hızlı bir konfokal mikroskobun merceğinin altına sığacak kadar küçüktür.
Yüzey aktif madde filmlerinin kapladığı hava-su arayüzleri günlük yaşamda her yerde bulunur. Yüzey aktif madde-su enjeksiyonları, tükenmiş alanlardan petrol geri kazanımını arttırmak için kullanılır ve kaya gazı ve petrol için hidrolik kırılma çözümleri olarak kullanılır. Gaz-sıvı köpükler ve sıvı-sıvı emülsiyonlar, yağlayıcılar ve temizlik maddeleri olarak birçok endüstriyel ve bilimsel proseste ortaktır ve gıdalarda yaygındır. Arayüzlerdeki yüzey aktif maddeler ve proteinler, paketleme, depolama ve uygulama sırasında antikor konformasyonlarını stabilize eder 1,2,3,4,5, gözdeki gözyaşı filmi stabilitesi 6,7,8 ve pulmoner mekanik9,10,11,12,13,14, 15.
Arayüzlere adsorbe olan yüzey aktif ajanların veya yüzey aktif maddelerin ve özelliklerinin incelenmesi, birçok farklı deneysel teknikle uzun bir geçmişe sahiptir 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Son zamanlarda ortaya çıkan bir gelişme, diğer yaygın yöntemlerden önemli ölçüde daha az malzeme kullanırken, çok daha küçük uzunluk ölçeklerinde, yüksek kavisli arayüzlerde ara yüzey özelliklerinin incelenmesine izin veren kılcal basınç mikrotensiyometresidir (CPM) 9,23,24,25. Konfokal floresan mikroskobu (CFM), CPM 22’deki hava-su arayüzlerinde veya Langmuir oluklarında 20,26,27,28,29’daki lipitlerin ve proteinlerin morfolojisini incelemek için kullanılabilir. Burada bir CPM ve CFM, biyolojik ve teknolojik arayüzler için yapı-işlev ilişkileri geliştirmek üzere morfolojik fenomenleri dinamik ve denge ara yüzey özelliklerine bağlamak için birleştirilmiştir.
CPM-CFM’nin erişebildiği ara yüzey aktif madde sistemlerinde çok sayıda önemli parametre vardır. CPM’de, 30-200 μm çapında bir hava kabarcığı bir cam kılcal tüpün ucuna sabitlenir. CPM’nin önceki versiyonlarında, kabarcığın içi ve dışı arasındaki kılcal basınç farkı bir su sütunu ve salınımlı şırınga pompası 9,30 ile kontrol edildi; burada açıklanan yeni versiyon, bunları daha yüksek hassasiyetli, bilgisayar kontrollü bir mikroakışkan pompa ile değiştiriyor. Yüzey gerilimi (γ), ΔP = 2γ / R Laplace denklemi aracılığıyla, pompa tarafından ayarlanan arayüz boyunca basınç düşüşünden, ΔP ve kabarcığın eğrilik yarıçapının optik analizinden, R’den belirlenir. Arayüzün dinamik yüzey gerilimi, çözünür bir yüzey aktif madde içeren dökme bir sıvı ile temas halinde yeni bir kabarcığın oluşturulmasını takiben 10 ms zaman çözünürlüğü ile belirlenebilir. Yüzey aktif madde adsorpsiyon dinamikleri, difüzyon, yüzey kapsamı ve kütle konsantrasyonu ile denge yüzey gerilimi arasındaki ilişki de dahil olmak üzere yüzey aktif maddenin temel özelliklerini belirlemek için klasik Ward-Tordai denklemi 10,31 ile tanımlanabilir. Bir denge yüzey gerilimi elde edildikten sonra, ara yüzey alanı, kabarcık yüzey alanındaki küçük değişikliklerin neden olduğu yüzey gerilimindeki değişiklikleri kaydederek, dilatasyonel modülü ölçmek için salınımlı olabilir, A32. Dolaşık polimerler veya proteinler gibi kendi iç yapılarını geliştiren daha karmaşık arayüzler için, yüzey gerilimi, daha genel bir yüzey gerilimi 4,33, ile değiştirilir.
Solunum sırasındaki akciğer stabilitesi, alveolar hava-sıvı arayüzünde hem düşük yüzey geriliminin hem de yüksek dilatasyonel modülün korunmasına doğrudan bağlı olabilir 9,10. Tüm iç akciğer yüzeyleri, doku hidrasyonunu korumak için sürekli, mikron kalınlığında bir epitel astar sıvısı filmi ile kaplanmıştır34. Bu epitel astar sıvısı öncelikle sudur, tuzlar ve diğer çeşitli proteinler, enzimler, şekerler ve akciğer yüzey aktif maddesi içerir. Herhangi bir kavisli sıvı-buhar arayüzünde olduğu gibi, alveolusun (veya kabarcığın) iç kısmında daha yüksek olan basınçla kılcal bir basınç indüklenir. Bununla birlikte, yüzey gerilimi akciğerlerin her yerinde sabit olsaydı, Laplace denklemi, ΔP = 2γ / R, daha küçük alveollerin daha büyük alveollere göre daha yüksek bir iç basınca sahip olacağını ve daha küçük alveollerin gaz içeriğini daha büyük, daha düşük basınçlı alveollere akmaya zorladığını gösterir. Bu, “Laplace Kararsızlığı” olarak bilinir9,35. Net sonuç, en küçük alveollerin çökeceği ve sıvı ile doldurulacağı ve akciğerin bir kısmının çökmesine neden olacak şekilde yeniden şişirilmesi zorlaşacak ve diğer kısımların aşırı şişeceğidir, her ikisi de akut solunum sıkıntısı sendromunun (ARDS) tipik semptomlarıdır. Bununla birlikte, düzgün çalışan bir akciğerde, alveolus ara yüz bölgesindeki hava-epitelyal sıvı arayüzü solunum sırasında genişledikçe ve büzüldükçe yüzey gerilimi dinamik olarak değişir. Eğer , veya , Laplace basıncı azalan yarıçapla azalır ve Laplace dengesizliğini ortadan kaldırmak için artan yarıçapla artar, böylece akciğer9’u stabilize eder. Bu nedenle, ve frekansa, tek katmanlı morfolojiye ve bileşime ve alveoler sıvı kompozisyonuna nasıl bağlı olduğu akciğer stabilitesi için gerekli olabilir. CPM-CFM ayrıca ara yüzey eğriliğinin yüzey aktif madde adsorpsiyonu25, tek katmanlı morfoloji 22 ve dilatasyonel modül9 üzerindeki etkilerinin ilk gösterimlerini sağlamıştır. CPM’deki rezervuarın küçük hacmi (~ 1 mL), sıvı fazın hızlı bir şekilde tanıtılmasına, çıkarılmasına veya değiştirilmesine izin verir ve gerekli miktarda pahalı protein veya yüzey aktif maddeyi en aza indirir10.
CPM-CFM görüntüsündeki kontrast, floresan olarak etiketlenmiş lipitlerin veya proteinlerin küçük fraksiyonlarınınarayüz 16,27’de dağılmasından kaynaklanmaktadır. İki boyutlu yüzey aktif madde monokatmanları genellikle yüzey gerilimi veya yüzey basıncının bir fonksiyonu olarak yanal faz ayrımı sergiler, π 0 γ temiz bir sıvı-sıvı arayüzünün yüzey gerilimi ile yüzey faktan kaplı bir arayüz arasındaki farktır γ. π, saf sıvı yüzey gerilimini düşürmek için hareket eden arayüzdeki yüzey aktif madde moleküllerinin etkileşimlerinin neden olduğu 2-D “basınç” olarak düşünülebilir. Düşük yüzey basınçlarında, lipit monokatmanları sıvı benzeri düzensiz bir durumdadır; bu, sıvı genişlemiş (LE) faz olarak bilinir. Yüzey basıncı arttıkça ve lipit molekülü başına düşen alan azaldıkça, lipitler birbirleriyle birlikte yönlendirilir ve uzun menzilli sıralı sıvı yoğunlaştırılmış (LC) faz 16,20,27’ye birinci dereceden bir faz geçişine geçebilir. LE ve LC fazları çeşitli yüzey basınçlarında bir arada bulunabilir ve floresan etiketli lipitler LC fazından dışlanıp LE fazına ayrıldığı için görselleştirilebilir. Böylece, CFM16 ile görüntülendiğinde LE fazı parlak ve LC fazı karanlıktır.
Bu makalenin amacı, kombine konfokal mikroskop mikrotensiyometresini oluşturmak ve çalıştırmak için gerekli adımları tanımlamaktır. Bu, okuyucunun adsorpsiyon çalışmaları yapmasına, yüzey gerilimini, reolojik davranışı ölçmesine ve mikron ölçekli bir hava / su veya yağ / su arayüzünde aynı anda ara yüzey morfolojisini incelemesine olanak tanır. Bu, gerekli kılcal damarların nasıl çekileceği, kesileceği ve hidrofobikleştirileceği, basınç, eğrilik ve yüzey alanı kontrol modlarının kullanımı için talimatlar ve çözünmeyen yüzey aktif maddenin mikrotensiyometre kavisli arayüze ara yüz transferi hakkında bir tartışmayı içerir.
Kombine CPM / CFM, ara yüz dinamiklerini, dengeyi ve morfolojiyi incelemek için güçlü bir araçtır. Bu protokol, CPM/CFM ile veri elde etmek için gerekli adımları açıklar.
Şekil 2 , belirtilen kılcal damar, çözücü ve ısı değişimi için kanallara sahip hücre tasarımını göstermektedir. Solvent değişimi için giriş hücrenin altında olmalı, çıkış ise en üstte olmalı ve değişim sırasında hücrenin taşmamasına izin vermelidir….
The authors have nothing to disclose.
Tüm konfokal mikroskopi görüntüleri Nikon A1RHD Multiphoton dik konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi. Minnesota Üniversitesi Üniversite Görüntüleme Merkezi’ndeki destek personelinin, özellikle Guillermo Marques’in rehberliğini ve yardımını kabul ediyoruz. Bu çalışma NIH Grant HL51177 tarafından desteklenmiştir. SI, Ruth L. Kirschstein NRSA Kurumsal Araştırma Eğitim Hibe F32 HL151128 tarafından desteklenmiştir.
1.5 O.D. Tygon tubing | Fischer Scientific | Tubing | |
A1RHD Multiphoton upright confocal microscope | Nikon | Confocal Microscope | |
Acid Cleaning Solution | Sulfuric acid and Alnochromix diluted with water 50% by volume, wait until clear befor diluting | ||
Alnochromix | Alconox | 2510 | Mixed with sulfuric acid to package instructionand diluted to make acid cleaning solution |
Ceramic glass cutter | Sutter Instruments | ||
Chloroform | Sigma-Aldrich | 650471 | HPLC Plus |
Curosurf | Chiesi | Lung Surfactant | |
Di Water | 18.5 MΩ – cm | ||
Ethanol | any | 200 proof used for hydrophobization, denatured used for cleaning | |
Fiber-Lite Model 190 fiber optic illuminator | Dolan-Jenner Industries Inc. | 281900100 | Light source; other light sources should work as well |
Flow EZ F69 mbar w/Link Module | Fluigent | LU-FEZ-0069 | Microfluidic Pump |
Fluigent SDK VIs | Fluigent | Required for CPM virtual Interface | |
Fluoroelastomer gaskets | Machined from 1 mm thick Viton sheet, See figure 3 | ||
Gas filter | Norgren | F07-100-A3TG | Put between microfluidic pump and pressure regulator |
Gas regulator | Norgren | 10R0400R | Steps down pressure from sorce to range of pump, connected to gas filter range 2-120 psi |
Glass Capilary | Sutter Instruments | B150-86-10 | Borosilicate glass O.D. 1.5 mm I.D. 0.86 mm |
Glass Slide | any | 75 mm x 25 mm | |
Glass Syringe | Hamilton | 84878 | 25 μL glass syringe |
Hydrophobizing Agent | Sigma-Aldrich | 667420 | 1H,1H,2H,2H-Perfluoro-octyltriethoxysilane 98%, other hydrophobic triethoxysilane can be substituted |
Insoluble surfactant | Avanti | 850355C-200mg | 16:0 DPPC in chloroform |
LabVIEW Software | National Instruments | 2017 | |
Longpass Filter | ThorLabs | FEL0650 | 650 nm Longpass filter, wavelength must remove excitation lazer frequence |
Lyso-PC | Avanti | 855675P | 16:0 Lyso PC 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine |
Masterflex L/S variable speed analog consol pump system w/ Easy-Load II pump head | Masterflex | HV-77916-20 | Peristaltic Pump |
MATLAB | Mathworks | R2019 | |
Micropipette Puller P-1000 | Sutter Instruments | Capillary Puller | |
Microtensiometer Cell and Holder | Cell machined from PEEK, holder machined from aluminum, See Figure 3 and 4 | ||
Microtensiometer Objective | Nikon | Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 mm | |
NI Vision Development Module | National Instruments | Required for CPM virtual Interface | |
PEEK finger tight fittings | IDEX | F-120x | 10-32 Coned Ports |
PEEK plug | IDEX | P-551 | 10-31 Coned Ports |
pippette tips | Eppendorf | 22492225 | 100 μL – 1000 μL, Autoclaved |
Plastic Forceps | Thermo Scientific | 6320-0010 | |
Plastic Syringe | Fischer Scientific | 14-955-459 | 10 mL |
Plumbing parts | Fischer Scientific | 3-way valves and other plumbing parts to connect tubing. | |
Research Plus 1-channel 100 μL–1000 μL | Eppendorf | 3123000063 | Micro pipetter |
Sulfuric Acid | any | Used for acid cleaning solution | |
T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm | Nikon | Confocal Microscope Objective | |
Texas Red DHPE triethylammonim salt | Thermo Fischer Scientific | 1395MP | Fluorophore |
Vaccum Pump | Gast | DOA-P704-AA |