固定胚胎小鼠组织以进行细胞内膜分析

该协议遵循机构动物护理和使用委员会（IACUC）和圣裘德儿童研究医院批准的动物护理指南。所有菌株都与C57BL / 6J菌株进行了五代的交叉。 1. 胚胎分离和整个安装染色 饲养6周龄的雌性并监测阴道塞的存在。 根据 AVMA 指南18，在 CO2 腔室中吸入 CO2，然后进行宫颈脱位，对妊娠大坝实施安乐死。使用解剖剪刀和镊子在腹膜腔做一个Y形切口。根据批准的机构指南切除含有E9.5胚胎的子宫。 在完全生长培养基中解剖胚胎（Dulbecco的改性鹰培养基，补充非必需氨基酸，丙酮酸钠，L-谷氨酰胺和10%胎牛血清）。使用镊子去除卵黄囊、胎盘和周围膜。注意：需要时，保存每个卵黄囊用于胚胎基因分型。 在汉克的平衡盐溶液（HBSS）中冲洗分离的胚胎，以去除任何残留的羊膜组织和血液。 准备固定剂。在 HBSS 中添加多聚甲醛 （PFA），最终工作浓度为 4%PFA。注意：PFA是一种有毒化学物质，因此必须避免吸入或直接接触皮肤。固定溶液的制备在通风橱下进行，并配有适当的个人防护设备，如手套和实验室外套。 向24孔板的每个孔中加入1 mL固定剂，并将每个胚胎放入单个孔中。将胚胎在固定剂中孵育45分钟，并在摇杆上轻轻搅拌。注意：关键：所有洗涤和孵育必须在摇臂或圆形摇 床上轻轻搅拌 （最大20 RPM），因为胚胎的突然处理或移动会破坏固定的细胞因。使用移液器轻轻地取出所有溶液。 取出固定剂，并在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中用Ca2 + 和Mg 2+ 加入0.1%曲拉子洗涤胚胎3×30分钟。 洗涤后，将胚胎在封闭溶液（PBS与Ca2 + 和Mg2 +，0.1%曲里通和5%山羊血清）中孵育，轻轻搅拌。块2 x 1小时。在第二次封闭孵育后，使用新鲜的封闭溶液对胚胎进行一次快速冲洗。 在第二个封闭步骤中，制备一抗溶液11。用Ca2+和Mg 2+ ，0.1%吐温-20和5%山羊血清将抗体稀释至PBS中的优化浓度。注意：为了增强膜GFP的可视化，可以使用鸡肉抗GFP（1：250）。 除去封闭溶液并向每个孔中加入1 mL一抗溶液。在4°C下温和旋转孵育3天。 一抗孵育后，在PBS的摇杆上用Ca2 + 和Mg 2+，0.1%吐温-20和5%山羊血清以20 RPM的速度洗涤胚胎5×1小时。 使用F（ab’）2 片段次级试剂在PBS中以1：1，000稀释度与Ca2 + 和Mg2 +，0.1%吐温-20和5%山羊血清制备二抗溶液。注意：使用F（ab’）2 片段可大大增强抗体在样品中的渗透性。 向每个孔中加入1 mL二抗溶液。在黑暗中在4°C下轻轻摇动孵育3天。注意：重要提示：从此时起，尽量减少胚胎暴露在直射光下。可选：为防止细菌生长，在二抗溶液中加入0.2%叠氮化钠。 取出二抗溶液，用Ca2 +和Mg 2 + ，0.1%吐温-20和5%山羊血清在PBS中洗涤胚胎3×30分钟。如果不用鬼灭英或其他肌动蛋白染料进行肌动蛋白染色，在第一次洗涤后，将4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）加入PBS中，加入Ca2 + 和Mg2 +，0.1%吐温-20和5%山羊血清并孵育1小时，然后如上所述洗涤3×30分钟。注意：此时，胚胎可以在4°C的PBS或HBSS中在黑暗中储存过夜，直到第二天进行包埋步骤。但是，建议立即嵌入胚胎并切片。 2. 胚胎包埋、切片和安装 准备溶解在HBSS或PBS中的4%w / v低熔点（LMP）琼脂糖溶液，其中Ca2 + 和Mg2 + 至每个胚胎的最终体积〜3 mL。将适当重量的 LMP 琼脂糖加入含钙2+ 和 Mg 2+ 的 HBSS 或 PBS 中，微波加热，直到 LMP 琼脂糖溶解。注意：一旦LMP琼脂糖溶解，将溶液储存在珠浴，培养箱或设置为55°C的水浴中，以防止LMP琼脂糖溶液凝固。 使用12孔板作为胚胎的包埋模具。将12孔板置于55°C珠浴中。向每个将容纳胚胎的孔中加入2.5-3 mL 4%LMP琼脂糖。注意：虽然可以使用其他模具，但12孔板体积是后期制备琼脂糖块以进行切片的最佳选择。 使用穿孔勺子将胚胎转移到含有4%LMP琼脂糖溶液的单个孔中（图1A）。 将12孔板从珠浴转移到台面上。使用移液器吸头轻轻嵌入和定向胚胎，使其在溶液中居中。一旦胚胎取向，将板置于-20°C下10分钟，以使块快速凝固。关键：确保胚胎位于块的中心。下沉到底部或太靠近模具边缘的胚胎可能会在切片时从琼脂糖块中脱落。 使用手术刀从孔中取出整个琼脂糖块，并在胚胎周围切割一个矩形块，每侧留下约0.3厘米的块。沿着胚胎的尾端允许额外的长度。当安装在振动组上时，将胚胎定向到块上部的直立位置（图1B）。 将一条胶带贴在振动组的标本支架上，并将琼脂糖块超胶合到胶带上，定向使叶片在后序列的前（颅骨）中产生胚胎的轴向切片。 用冷的HBSS填充振动室以确保样品完全浸入，然后用冰包围室。 将振动切片机 速度 设置为 0.2 mm/s ， 频率 在 5 到 7 （50-70 Hz） 之间， 切割厚度 设置为 100 μm。对胚胎进行连续的轴向切片。注意：使用较慢的速度进行切片。如果切割速度增加到0.25 mm / s以上，切片可能会撕裂胚胎或将胚胎从块中移走。 在切片系列中，使用镊子将各个切片轻轻地转移到装满HBSS的单独的60毫米培养皿中。使用镊子抓住块，而不是组织，以避免组织损伤和细胞介素的破坏。注意：组织切片应保留在琼脂糖块内。如果组织从块中落入振动室，则通过抬起切片轻轻转移。不要抓住或捏住纸巾。严重：任何组织切片的折叠或突然的处理都会破坏组织切片中的固定细胞因子。 如果不进行F-肌动蛋白染色，请继续执行步骤2.10。 为了进行F-肌动蛋白染色，除去HBSS并用在室温下在PBS 中稀释的肌动蛋白红和DAPI溶液孵育切片40分钟，0.1%吐温-20和5%山羊血清。 在PBS中用Ca 2 +和Mg2 + 以及0.1%吐温-20 洗涤切片3 x 20分钟。 使用疏水性记号笔，在带电显微镜载玻片的边缘周围绘制疏水屏障，并添加少量HBSS以填充该区域。 使用镊子或穿孔勺将切片转移到载玻片上。注意：任何未被琼脂糖包裹的组织切片都可以 通过 转移移液器转移。 使用镊子去除多余的琼脂糖块。 一旦所有部分都转移到载玻片上， 通过 移液和吸收性纸巾的角落除去多余的液体，然后将几滴安装介质添加到载玻片中。固化后，使用足够的安装介质覆盖整个盖玻片区域。轻轻地将盖玻片放在滑轨上，以安装盖玻片。注：在安装介质固化之前，避免施加压力或干扰盖玻片。 3. 成像 在任何共聚焦或更高分辨率的显微镜11上对组织切片进行成像。每个基因型至少分析三个胚胎。注意：使用TCS SP8 STED 3x共聚焦显微镜获取组织切片的图像，然后进行闪电反卷积。