Reconstituição da Assembleia septina em membranas para estudar propriedades e funções biofísicas

As formas das células e muitos de seus compartimentos internos dependem das membranas lipídicas que as cercam. As membranas são estruturas viscoelásticas que podem ser deformadas através de interações com proteínas, triagem lipídica e atuação de forças internas e externas para gerar uma variedade de formas 1,2,3,4. Essas formas são frequentemente descritas em termos de curvatura de membrana. As células utilizam um conjunto diversificado de proteínas capazes de se reunir preferencialmente, ou “sensoriamento”, curvaturas de membrana específicas para garantir o controle espátula-temporal definido sobre processos como tráfico celular, citocinas e migração ^5,6. A dinâmica do maquinário celular na membrana é notavelmente difícil de observar devido à dificuldade de equilibrar o tempo e a resolução espacial com a saúde celular. Embora as técnicas de superrespeição possam oferecer uma visão detalhada de tais estruturas, elas exigem aquisições longas que não são favoráveis às escalas de tempo de montagem/desmontagem para a maioria das máquinas. Além disso, a complexidade molecular desses conjuntos em seu ambiente nativo e a multiplicidade de papéis que um único componente pode desempenhar fazem dos sistemas mínimos de reconstituição uma ferramenta valiosa para estudar a capacidade funcional das moléculas.

A mímética de membrana mínima foi desenvolvida para estudar propriedades de membrana e interações proteína-membrana fora da célula. Os miméticos de membrana variam de bicamadas lipídicas de pé livre, como lipossomos ou vesículas unilamellar gigantes, até bicamadas lipídicas suportadas (SLBs)7,8,9,10. SLBs são membranas biomiméticas ancoradas ao suporte subjacente, tipicamente composto de vidro, mica ou sílica ^11,12. Uma variedade de geometrias pode ser usada, incluindo superfícies planares, esferas, hastes e até substratos ondulantes ou micropatterados para sondar interações proteína-membrana em curvaturas côncavas e convexas simultaneamente¹ 3,14,15,16,17,18 . A formação de bicamadas começa com a adsorção de vesículas em uma superfície hidrofílica, seguida de fusão e ruptura para formar uma bicamada contínua (Figura 1)¹⁹. Bicamadas suportadas são particularmente favoráveis à microscopia de luz e elétrons, fornecendo melhor tempo e resolução espacial do que muitas vezes é alcançável nas células. Os SLBs curvos fornecem especialmente um meio atraente para sondar a sensibilidade à curvatura da proteína na ausência de deformação significativa da membrana, permitindo que se distingue entre sensor de curvatura e indução de curvatura, que muitas vezes são impossíveis de separar em sistemas autônomos.

Os septinos são uma classe de proteínas citoesqueletal formadoras de filamentos bem conhecidas por sua capacidade de se reunir em membranas positivamente curvas ^6,18,20. Ao longo do ciclo celular na levedura, os septinos se reúnem em um anel e devem reorganizar-se para formar as estruturas de ampulheta e anel duplo associadas ao surgimento de brotos e citocinese, respectivamente²¹. Embora belo trabalho tenha sido feito usando microscopia eletrônica de réplica de platina para observar a arquitetura de septina em diferentes estágios de ciclo celular²², assistir ao conjunto de septina ao longo do tempo usando microscopia de luz na levedura encontrou-se com resolução espacial limitada. Trabalhos anteriores em septinas usando monocamadas lipídicas visualizadas pela microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foi capaz de reconstituir várias estruturas de septina interessantes, como anéis, feixes e gazes²³. No entanto, as técnicas EM também são limitadas em sua resolução temporal, ao contrário da microscopia de fluorescência. A fim de melhor resolver os parâmetros cinéticos do processo multies em escala da montagem de septina, recorremos a miméticas de membrana suportadas, onde podemos controlar cuidadosamente a geometria da membrana, as condições amostrais e a modalidade de imagem.

Os protocolos descritos aqui usam SLBs planar ou curvos, proteína purificada e uma combinação de técnicas de microscopia. A microscopia de fluorescência quantitativa e a microscopia total de fluorescência interna (TIRFM) foram utilizadas para medir tanto a ligação de proteína a granel em várias curvaturas de membrana, quanto para medir a cinética vinculante de moléculas únicas. Além disso, este protocolo foi adaptado para ser usado com microscopia eletrônica de varredura (SEM) para examinar a ultraestrutura proteica em diferentes curvaturas de membrana. Embora o foco desses protocolos esteja no citoesqueleto septino, os protocolos podem ser facilmente modificados para investigar a sensibilidade da curvatura de qualquer proteína que o leitor ache interessante. Além disso, aqueles que trabalham em áreas como endocitose ou tráfico vesicular podem achar essas técnicas úteis para sondar os conjuntos dependentes da curvatura de complexos multiprofissionais.