Rekonstitution von Septin-Assemblierungen an Membranen zur Untersuchung biophysikalischer Eigenschaften und Funktionen

Die Formen der Zellen und viele ihrer inneren Kompartimente hängen von den Lipidmembranen ab, die sie umgeben. Membranen sind viskoelastische Strukturen, die durch Wechselwirkungen mit Proteinen, Lipidsortierung und wirkende innere und äußere Kräfte verformt werden können, um eine Vielzahl von Formen^{zu erzeugen} 1,2,3,4. Diese Formen werden oft in Form von Membrankrümmung beschrieben. Zellen verwenden eine Vielzahl von Proteinen, die in der Lage sind, sich bevorzugt auf bestimmte Membrankrümmungen zu setzen oder diese zu “erfassen”, um eine definierte räumlich-zeitliche Kontrolle über Prozesse wie Zellverkehr, Zytokinese und Migration sicherzustellen ^5,6. Die Dynamik der Zellmaschinerie an der Membran ist aufgrund der Schwierigkeit, Zeit und räumliche Auflösung mit der Zellgesundheit in Einklang zu bringen, besonders schwer zu beobachten. Während Super-Resolution-Techniken eine detaillierte Ansicht solcher Strukturen bieten können, erfordern sie langwierige Akquisitionen, die für die meisten Maschinen nicht für die Zeitskalen der Montage / Demontage zugänglich sind. Darüber hinaus machen die molekulare Komplexität dieser Baugruppen in ihrer nativen Umgebung und die Vielzahl der Rollen, die eine einzelne Komponente spielen kann, minimale Rekonstitutionssysteme zu einem wertvollen Werkzeug für die Untersuchung der Funktionsfähigkeit von Molekülen.

Minimale Membranmimetika wurden entwickelt, um Membraneigenschaften und Protein-Membran-Interaktionen außerhalb der Zelle zu untersuchen. Die Membranmimetik variiert von freistehenden Lipiddoppelschichten wie Liposomen oder riesigen unilamellären Vesikeln bis hin zu unterstützten Lipiddoppelschichten (SLBs) 7,8,9,10. SLBs sind biomimetische Membranen, die auf dem darunter liegenden Träger verankert sind und typischerweise aus Glas, Glimmer oder Kieselsäure^11,12 bestehen. Eine Vielzahl von Geometrien kann verwendet werden, einschließlich planarer Oberflächen, Kugeln, Stäbchen und sogar wellenförmiger oder mikrostrukturierter Substrate, um Protein-Membran-Wechselwirkungen auf konkaven und konvexen Krümmungen gleichzeitig zu untersuchen¹ 3,14,15,16,17,18 . Die Bilayer-Bildung beginnt mit der Adsorption von Vesikeln auf eine hydrophile Oberfläche, gefolgt von Fusion und Bruch zu einer kontinuierlichen Doppelschicht (Abbildung 1)¹⁹. Unterstützte Doppelschichten sind besonders licht- und elektronenmikroskopisch zugänglich und bieten sowohl eine bessere zeitliche als auch eine bessere räumliche Auflösung, als dies in Zellen oft möglich ist. Gekrümmte SLBs bieten insbesondere ein attraktives Mittel, um die Proteinkrümmungsempfindlichkeit ohne signifikante Membranverformung zu untersuchen, so dass zwischen Krümmungsmessung und Krümmungsinduktion unterschieden werden kann, die in freistehenden Systemen oft unmöglich zu trennen sind.

Septine sind eine Klasse von filamentbildenden zytoskelettalen Proteinen, die für ihre Fähigkeit bekannt sind, sich auf positiv gekrümmten Membranen zu sammeln ^6,18,20. Im Laufe des Zellzyklus in Hefe lagern sich Septine zu einem Ring zusammen und müssen sich neu anordnen, um die Sanduhr- und Doppelringstrukturen zu bilden, die mit der Knospenentstehung bzw. Zytokinese verbunden sind²¹. Während schöne Arbeiten mit Platin-Replikatelektronenmikroskopie durchgeführt wurden, um die Septinarchitektur in verschiedenen Zellzyklusstadien²² zu beobachten, ist die Beobachtung der Septin-Montage im Laufe der Zeit mit Lichtmikroskopie in Hefe auf eine begrenzte räumliche Auflösung gestoßen. Frühere Arbeiten an Septinen unter Verwendung von Lipidmonoschichten, die durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) sichtbar gemacht wurden, konnten mehrere interessante Septinstrukturen wie Ringe, Bündel und Gaze^{rekonstruieren 23}. Im Gegensatz zur Fluoreszenzmikroskopie sind EM-Techniken jedoch ebenfalls in ihrer zeitlichen Auflösung begrenzt. Um die kinetischen Parameter des Multiskalenprozesses der Septin-Montage besser zu lösen, haben wir uns der unterstützten Membranmimetik zugewandt, bei der die Membrangeometrie, die Probenbedingungen und die Bildgebungsmodalität sorgfältig kontrolliert werden können.

Die hier beschriebenen Protokolle verwenden planare oder gekrümmte SLBs, gereinigtes Protein und eine Kombination von Mikroskopietechniken. Die quantitative Fluoreszenzkonfokalmikroskopie und die totale interne Reflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRFM) wurden verwendet, um sowohl die Bindung von Massenproteinen an verschiedene Membrankrümmungen als auch die Bindungskinetik einzelner Moleküle zu messen. Darüber hinaus wurde dieses Protokoll angepasst, um mit der Rasterelektronenmikroskopie (REM) verwendet zu werden, um die Proteinultrastruktur auf verschiedenen Membrankrümmungen zu untersuchen. Während der Fokus dieser Protokolle auf dem Septin-Zytoskelett liegt, können die Protokolle leicht modifiziert werden, um die Krümmungsempfindlichkeit jedes Proteins zu untersuchen, das der Leser interessant findet. Darüber hinaus können diejenigen, die in Bereichen wie Endozytose oder vesikulärem Verkehr arbeiten, diese Techniken nützlich finden, um die krümmungsabhängigen Anordnungen von Multiproteinkomplexen zu untersuchen.