Una strategia per lo studio delle cellule linfoidi produttrici di IL-9 nel modello di infezione da Nippostrongylus brasiliensis
Summary
Le cellule T e ILC2 che esprimono IL-9 sono indotte durante l’infezione da N. brasiliensis , ma la loro caratterizzazione è stata ampiamente trascurata nell’intestino infetto a causa della loro bassa frequenza e cinetica differenziale. Questo protocollo descrive l’isolamento di queste cellule da diversi organi bersaglio e la conferma della loro identità tramite citometria a flusso in diversi stadi di infezione.
Abstract
IL-9 è una citochina pleiotropica associata a vari processi, tra cui l’immunità antitumorale, l’induzione di patologie allergiche e la risposta immunitaria contro le infezioni da elminti, dove svolge un ruolo importante nell’espulsione del parassita. In un modello murino di infezione da Nippostrongylus brasiliensis, IL-9 è prodotta principalmente dai linfociti T CD4 + e dalle cellule linfoidi innate presenti nel polmone, nell’intestino tenue e nei linfonodi drenanti. Date le difficoltà tecniche coinvolte nella colorazione intracellulare di IL-9, così come la complessità di isolare le cellule ematopoietiche dall’intestino tenue dopo l’infezione, vi è una pressante necessità di un protocollo completo ma semplice per analizzare l’espressione di IL-9 in diversi tessuti linfoidi e non linfoidi in questo modello. Il protocollo qui descritto delinea la cinetica di IL-9 prodotta dalle cellule T CD4+ e dalle cellule linfoidi innate nel polmone e nell’intestino tenue, i principali organi bersaglio di N. brasiliensis, nonché nei linfonodi mediastinici e mesenterici, durante l’infezione. Inoltre, descrive in dettaglio il numero di larve necessarie per l’infezione, a seconda del tipo di cellula e dell’organo di interesse. Questo protocollo mira ad assistere nella standardizzazione dei saggi per risparmiare tempo e risorse offrendo l’opportunità di concentrarsi sulle cellule, gli organi e gli stadi specifici della malattia di interesse nel modello di infezione da N. brasiliensis.
Introduction
Gli anchilostomi sono parassiti intestinali che infettano circa 700 milioni di persone in tutto il mondo, soprattutto nelle aree tropicali dei paesi sottosviluppati. Le infezioni ad alta intensità da Ancylostoma duodenale e Necator americanus, i parassiti anchilostomi più comuni nell’uomo, causano anemia e carenza proteica che possono causare ritardo della crescita e dello sviluppo mentale1. N. americanus e il parassita dei roditori Nippostrongylus brasiliensis inducono una risposta immunitaria prototipica di tipo 2 nel loro ospite e condividono somiglianze nel loro ciclo vitale. Quindi, l’infezione dei topi con N. brasiliensis è il modello più comunemente usato per le infezioni da anchilostomi umani. Stadio 3 (L3) N. brasiliensis larve infettive si spostano dalla pelle al polmone nelle prime ore dopo l’infezione. Una volta nel polmone, diventano L4 e migrano lungo la trachea per essere inghiottiti, passare attraverso lo stomaco e raggiungere l’intestino per diventare adulti (L5) entro 4-5 giorni. Nell’intestino, i vermi L5 depongono le uova che vengono escrete nelle feci per riavviare il ciclo di vita del parassita2.
La risposta immunitaria indotta da N. brasiliensis è caratterizzata da un aumento di diverse citochine di tipo 2, tra cui IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 e IL-13, insieme a eosinofilia, basofilia, iperplasia del calice e dei mastociti e aumento della produzione di IgG1 e IgE. La maggior parte degli studi che cercano di identificare e definire le risposte immunitarie suscitate dall’infezione da N. brasiliensis sono incentrati sul ruolo di IL-4 o IL-13 in questo modello3. Tuttavia, l’identificazione e la caratterizzazione delle cellule che esprimono IL-9 e la funzione di questa citochina erano state ampiamente trascurate, fino a quando Licona-Limón et al. hanno pubblicato il primo studio che dimostrava un ruolo critico per IL-9 nella risposta immunitaria contro N. brasiliensis. Utilizzando topi reporter, questo studio ha descritto le cellule T (principalmente T helper 9) e le cellule linfoidi innate di tipo 2 (ILC2) come i principali sottogruppi cellulari che esprimono IL-9 dopo l’infezione4.
L’isolamento e la caratterizzazione di cellule immunitarie da polmoni infetti da elminti è fattibile, ed è stato ampiamente riportato 3,4. Tuttavia, a causa del rimodellamento dei tessuti intrinseco e della produzione di muco, farlo nell’intestino infetto si è rivelata una sfida tecnica, fino alla recente pubblicazione di Ferrer-Font et al.5. Il gruppo ha delineato un protocollo per isolare e analizzare sospensioni a singola cellula di sottogruppi immunitari da intestini murini infetti da Heligmosomoides polygyrus. Sulla base di esso, abbiamo ora standardizzato un protocollo per l’isolamento e l’analisi citometrica delle cellule linfoidi che esprimono IL-9 dall’intestino infetto da N. brasiliensis. Inoltre, abbiamo stabilito la cinetica di IL-9 da diverse fonti cellulari e posizioni anatomiche durante l’infezione.
Caratterizzare le distinte popolazioni cellulari coinvolte in questa infezione è vitale per una più ampia comprensione della risposta immunitaria al parassita e della sua interazione con l’ospite. Questo protocollo completo fornisce un percorso chiaro per isolare e analizzare le cellule produttrici di IL-9 dagli organi desiderati nelle fasi della malattia di interesse, consentendo un netto miglioramento delle conoscenze sul ruolo di queste cellule nell’infezione da N. brasiliensis e nelle infezioni parassitarie in generale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una comprensione completa delle interazioni parassita-ospite intestinale e delle risposte immunitarie all’infezione da elminti richiede l’identificazione e l’analisi delle diverse popolazioni cellulari e delle molecole effettrici che sono fondamentali per l’induzione del rimodellamento tissutale e l’espulsione dei vermi. Le infezioni da elminti trasmesse dal suolo rappresentano un grosso problema nei paesi in via di sviluppo di tutto il mondo. Tuttavia, fino a poco tempo fa, nonera disponibile un …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare José Luis Ramos-Balderas per il suo supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto dalla seguente sovvenzione a PLL da parte di CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P e EO-M hanno ricevuto una borsa di studio da CONACYT (rispettivamente 736162 e 481437). MCM-M ha ricevuto una borsa di studio da CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).
Materials
| ACK buffer | Homemade | ||
| Attune Nxt cytometer | Thermofisher | ||
| B220 | Biolegend | 103204 | |
| CD11b | Biolegend | 101204 | |
| CD11c | Biolegend | 117304 | |
| CD19 | Biolegend | 115504 | |
| CD4 | Biolegend | 100404 | |
| CD4 (BV421) | Biolegend | 100443 | |
| CD45.2 | Biolegend | 109846 | |
| CD8 | Biolegend | 100703 | |
| CD90.2 | Biolegend | 105314 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNAse I | Invitrogen | 18068015 | Specific activity: ≥10 000 units/mg |
| Facs ARIA II sorter | BD Biosciences | ||
| FACS Melody cell sorter | BD Biosciences | ||
| Fc-Block | Biolegend | 101320 | |
| FcεRI | eBioscience | 13589885 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| FlowJo | FlowJo | Flow cytometry analysis data software | |
| Gr-1 | Tonbo | 305931 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Homemade | ||
| IL-9 | biolegend | 514103 | |
| NK1.1 | Biolegend | 108704 | |
| Nylon mesh | lba | B07HYHHX5V | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Phosphate-buffered saline | Homemade | ||
| RPMI | Gibco | 11875093 | |
| Siglec F | Biolegend | 155512 | |
| Streptavidin | Biolegend | 405206 | |
| TCR-β | Biolegend | 109203 | |
| TCR-β (PE/Cy7) | Biolegend | 109222 | |
| TCR-γδ | Biolegend | 118103 | |
| Ter119 | Biolegend | 116204 | |
| Tricine buffer | Homemade | ||
| Zombie Aqua Fixable Viability Dye | Biolegend | 423101 |
References
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