Un enfoque microfluídico para el estudio de la cristalización de hidratos de hielo y clatrato

1. Fabricación de dispositivos microfluídicos Cubra la superficie interior de una placa de Petri con papel de aluminio y coloque el molde preparado previamente en la placa de Petri.Fabricar los moldes utilizando las técnicas de litografía descritas en las referencias. Los dos diseños de dispositivos utilizados en el presente trabajo se representan en la Figura 1. Prepare 30-40 ml de la mezcla de PDMS pesando una mezcla 1:10 (en peso) del agente de curado y el elastómero (consulte la Tabla de materiales) y mezclando continuamente durante aproximadamente 5 minutos hasta que la mezcla aparezca blanca y casi opaca.NOTA: Coloque un vaso de plástico en la báscula, vierta el elastómero en la taza y luego agregue el agente de curado para lograr una relación de peso de 1:10. Vierta la mezcla de PDMS en la placa de Petri con el molde y desgasifique en un desecador hasta que no queden burbujas (aproximadamente 30 min). Hornear el molde con el líquido PDMS en un horno o en una placa caliente a 70 °C hasta obtener una consistencia similar al caucho. Este proceso dura aproximadamente una hora. Corte el dispositivo trazando las características con un bisturí, teniendo cuidado de empujar hacia adelante con el bisturí en lugar de hacia abajo, ya que el moho es frágil. Retire el dispositivo PDMS recortado y colóquelo boca abajo en una nueva placa de Petri. Elimine las partículas de polvo y suciedad de la superficie inferior colocando y retirando un trozo de cinta adhesiva (consulte la Tabla de materiales). Utilice una aguja de jeringa roma (20 G) para perforar agujeros en el dispositivo según el patrón impreso, utilizando un microscopio si es necesario. Asegúrese de que el orificio penetre por el otro lado del dispositivo y use pinzas para quitar las piezas perforadas. Lave bien un cubreobjetos (18 x 18 mm, 0,14 mm de grosor) con agua y jabón, y luego con isopropanol. Use presión de aire para secar el cubreobjetos limpio. Inserte el PDMS limpio y el cubreobjetos en el limpiador de plasma, cierre las válvulas y encienda la alimentación, la aspiradora y la bomba. Deje que el limpiador de plasma funcione durante aproximadamente un minuto, ajuste la RF a HI y permita que entre algo de aire en el limpiador de plasma con la válvula fina.Cuando el color de la ventana de visualización cambie de púrpura a rosa, deje que el limpiador de plasma funcione durante 50 s y apague la RF. Mantenga la bomba encendida durante un minuto y, después de apagarla, abra gradualmente la válvula principal para permitir que el aire entre en el limpiador de plasma.NOTA: Un método alternativo para lograr resultados comparables es la unión térmica. Para este método, coloque el molde en el cubreobjetos y colóquelo en una placa caliente a 70-80 ° C durante aproximadamente 60 minutos. Presione la superficie del PDMS sobre el cubreobjetos limpio y confirme que están unidos sin observar ningún desprendimiento al tirar ligeramente hacia arriba del cubreobjetos. Asegure la aguja de una aguja roma de 90° (18 G) con un par de alicates y tire del conector de la jeringa de plástico para extraerla. Inserte un extremo de la aguja en un tubo Tygon (0.020″ ID, 0.060″ OD, consulte la Tabla de materiales) y el otro extremo en uno de los orificios perforados del dispositivo. Repita el proceso para los otros agujeros. Para eliminar las burbujas de aire, inyecte agua/tampón en los canales con una jeringa de vidrio (una bomba es opcional, pero aquí no se usó ninguna bomba). Filtre todos los líquidos con un filtro de 0,22 μm antes de inyectarlos en el dispositivo. Use un agente bloqueador como una solución BSA al 1% para evitar la unión de AFP marcadas con fluorescencia en las paredes del PDMS. Inyecte el agente bloqueador en el canal de entrada y deje que permanezca en los microcanales durante 20 minutos. Luego, inyecte la solución tampón en el canal de entrada para eliminar la solución BSA.NOTA: El dispositivo PDMS resultante está conectado a un cubreobjetos a lo largo de su superficie inferior, conectado a un tubo en sus orificios de entrada y salida, y recubierto con un agente bloqueador en sus canales. 2. Configuración del dispositivo microfluídico Aplique una pequeña cantidad de aceite de inmersión en la superficie de la etapa fría de cobre (consulte la Tabla de materiales) y extiéndala con una toallita sin pelusa para crear una capa delgada de aceite. A continuación, coloque un disco de zafiro limpio (consulte la Tabla de materiales) en la capa de aceite creada. Aplique una gota de aceite de inmersión en el centro del disco de zafiro y coloque el dispositivo PDMS en la gota de modo que las características del dispositivo estén alineadas sobre el orificio de visualización de la etapa fría. Mantenga el dispositivo en su lugar y asegure el tubo a las paredes exteriores de la caja de aluminio que alberga la etapa fría con cinta adhesiva. Tome nota de la colocación de cada tubo específico. Use una jeringa de vidrio para inyectar 4-5 μL de solución AF(G)P (ver Tabla de materiales) en el canal de entrada. Cierre la tapa de la etapa fría.NOTA: La concentración de las soluciones de AFP puede variar y decidirse en función de su intensidad de fluorescencia. En el protocolo actual, el rango de concentraciones era de 5-40 μL. 3. Formación de monocristales en los canales microfluídicos Purgue la etapa fría con aire seco / nitrógeno para evitar que se forme condensación en su interior. Active un baño de enfriamiento circulante para hacer circular el agua a través de la etapa fría y servir como disipador de calor. Inicie el programa de control de temperatura y ajuste la temperatura a -25 °C.NOTA: La congelación ocurrirá a medida que la muestra alcance una temperatura de ~-20 ° C, que se puede observar como un oscurecimiento y rugosidad repentinos de la muestra. En este punto se puede utilizar cualquier objetivo, preferiblemente el objetivo 4x, que permite al usuario observar la totalidad de los canales microfluídicos. Lentamente, aumentando la temperatura en aproximadamente 1 °C/5 s, acercarse al punto de fusión de la muestra, que puede variar de -1 a -0,2 °C dependiendo del tampón utilizado en la solución AF(G)P. A medida que la temperatura se acerca al punto de fusión, espere hasta que se aíslen algunos cristales individuales.NOTA: Si es necesario, el hielo no deseado se puede derretir localmente usando un láser IR (980 nm) (consulte la Tabla de materiales), que se fija en el microscopio. El láser derrite los cristales de hielo cercanos mientras esté encendido. En este punto, se recomienda cambiar a objetivos 10x o 20x para observar mejor los cristales individuales. Después de obtener un solo cristal en la ubicación deseada, haga crecer el cristal disminuyendo ligeramente la temperatura (en ~ 0.01 ° C) hasta que los bordes del cristal se encuentren con las paredes del canal. Cambie al objetivo 50x, inyecte la solución AF (G) P en los canales y observe el aumento de la intensidad de fluorescencia, lo que indica que la solución de proteína se inyectó con éxito en los canales. Realice este paso con cuidado para evitar la fusión del cristal de hielo durante el intercambio de soluciones. Controle y ajuste de cerca tanto el caudal (aplicando más/menos presión sobre la jeringa de vidrio) como la temperatura durante el proceso de intercambio de la solución. Permita que las proteínas tengan tiempo suficiente para acumularse y unirse a la superficie del cristal.NOTA: Esto varía en función de las tasas de acumulación y adsorción del AF(G)P 5,25. En un experimento típico, se permiten 5-10 minutos para la acumulación de AFP 4. Medición de la actividad de histéresis térmica (TH) NOTA: Este paso es opcional. Determine el punto de fusión del cristal ajustando la temperatura con pequeños pasos de 0.002 ° C y observando la temperatura más alta a la que se puede someter un cristal pequeño sin que se derrita. En la función RAMP del controlador de temperatura, ajuste la velocidad de enfriamiento a -0.05 a -0.01 °C / 4 s y active la RAMPA. Tenga en cuenta la temperatura exacta a la que se produce el crecimiento repentino de cristales.NOTA: Este valor se denomina temperatura de explosión y corresponde a la temperatura de congelación. La diferencia entre las temperaturas de fusión y congelación es la actividad TH25. 5. Intercambio de soluciones alrededor de cristales individuales Asegúrese de que la temperatura de la muestra esté en el espacio TH para evitar la fusión o el crecimiento del cristal durante el experimento. Registre el proceso de intercambio de soluciones utilizando el programa de imágenes NIS Elements (consulte Tabla de materiales) para un análisis posterior de los datos de fluorescencia. Inyecte lentamente la solución tampón en la segunda entrada del dispositivo microfluídico y observe una disminución en la señal fluorescente a una velocidad que depende de la presión aplicada a la jeringa.Utilice esta representación visual para asegurarse de que la presión aplicada no sea demasiado alta para no hacer que el cristal se derrita. Consulte la figura 2 para obtener una secuencia de imágenes que muestran el proceso de intercambio de soluciones. Mida la intensidad de fluorescencia en el canal microfluídico utilizando el programa de imágenes.NOTA: La señal debe alcanzar su punto máximo en la región cercana a la superficie del cristal, lo que indica la unión de AFP, y debe ser relativamente baja en la solución circundante, que se ha lavado con tampón. Mida la actividad TH después del intercambio de soluciones siguiendo el paso 4. Repita el experimento aislando un nuevo cristal (pasos 3.3-3.5). Inyecte la solución de AFP con una jeringa de vidrio y repita el intercambio de la solución (pasos 5.1-5.3). Obtenga un nuevo monocristal (pasos 3.3-3.5) y haga fluir la solución de AFP hacia los canales utilizando la jeringa de vidrio. 6. Experimentos con hidratos de clatrato Para obtener hidratos de THF, prepare una solución THF/agua con una relación molar de 1:15, que es una relación de volumen de 1:3.326. Mantener esta relación en todas las soluciones utilizadas en los siguientes experimentos, incluidas las que contienen AF(G)Ps u otros inhibidores. Siga los pasos 1 y 2 para preparar el dispositivo microfluídico y colocarlo en la etapa fría. Ajuste la temperatura a -25 °C; la muestra se congelará a ~-20 °C como se describe en el paso 3.2. Después de congelar la solución de THF, aumente lentamente la temperatura hasta que todo el hielo se haya derretido.NOTA: El punto de fusión del hielo está ligeramente deprimido por el THF. Para asegurarse de que todos los cristales de hielo se derritan con exclusión de los hidratos, mantenga la temperatura a 1 °C durante 3 min. Ajuste la temperatura a -2 °C y observe la abundancia de hidratos que aparecen en los canales microfluídicos en ausencia de inhibidores.NOTA: Los hidratos de THF tienen forma de octaedros (Figura 2), y en algunos casos, los cristales son muy delgados; Por lo tanto, la observación clara puede ser un desafío. En estos casos, se recomienda repetir los pasos 6.4-6.5 para obtener nuevos cristales. Inyecte el inhibidor de AF(G)P/en el canal microfluídico utilizando la jeringa de vidrio mientras ajusta la temperatura para asegurarse de que los cristales obtenidos no se derritan/crezcan. Espere unos minutos para que las moléculas inhibidoras se adsorban a la superficie del cristal. Si es necesario, mida la actividad TH siguiendo el paso 4. Intercambie la solución alrededor de los cristales como se describe en los pasos 5.2-5.3.