测量 秀丽隐杆线虫 对乙酰胆碱受体激动剂左旋咪唑的敏感性

1. 左旋咪唑测定用平板的制备 通过将3g NaCl，2.5g肽胨和17g琼脂与1L去离子（DI）水在带有搅拌棒的烧瓶中混合来制备线虫生长培养基（NGM）培养基。 高压灭菌后，将培养基放在设置为70°C的热板上，并以中等速度搅拌1小时。 向培养基中滴加 1 mL 5 mg/mL 胆固醇以防止沉淀，加入 1 mL 1 mCl2、1 mL 1 mL 1 M MgSO4 和 25 mL 1 M pH 6.0 磷酸钾缓冲液。 将2mLNG培养基转移到带有无菌血清学移液管的24孔板的每个孔中（图1）。 让板在台面上干燥2天，然后再接种细菌。为了长期储存，将它们放在4°C。 在溶生肉汤（LB）板上划出OP50 大肠杆菌 ，并在37°C下生长过夜。 将单个OP50菌落放入B-肉汤中（10克胰蛋白胨和5克NaCl在1L DI H2O中），并将培养物置于37°C振荡过夜。 使用无菌移液管，将30μLOP50悬浮液滴到每个孔中间的琼脂上（图1）。注意：确保不要损坏琼脂表面，因为这会导致蠕虫挖洞。 让板在室温下放置至少2天，以允许细菌草坪形成。注意：如果中心孔中的细菌在2天后不干燥，请将板在罩中打开20分钟（图1）。应在测定前1-2周将板倒入并用细菌接种。 2. 同步秀丽隐杆线虫 （第1天） 在6厘米的平板上将野生型，unc-63（x26），lev-10（x17）和 unc-49（e407）秀丽隐杆线虫 生长至成年期，每个菌株至少制备8个板。确认盘子上有许多非饥饿的重力成虫。注意：这是所需数量的两倍;然而，重要的是要有备用板，以防第一批鸡蛋在漂白过程中被破坏。 通过在750毫升DI水中搅拌溶解59.6克Na2HPO4 （二元），29.9克KH2PO4（单碱性），12.8克NaCl和2.5克MgSO4 ，制成10x M9缓冲液。溶解后，将体积调至1 L并过滤灭菌。稀释1：10并高压灭菌以制成1x M9缓冲液。注意：1x M9缓冲液可以提前几周或几个月制作。 在同步当天在引擎盖下准备漂白溶液。在 50 mL 锥形管中混合 10 mL 漂白剂（材料表）、2.5 mL 10 N NaOH 和 37.5 mL 去离子水。在使用漂白溶液时，请戴上护目镜，手套和实验室外套。 使用塑料转移移液管，用1x M9缓冲液从至少四个板中洗涤重力成虫，并将其转移到15 mL锥形管中。 在室温下以716× g 旋转1分钟，然后使用转移移液器除去上清液。 加入10毫升漂白溶液。倒置或轻轻摇动管约4分钟，直到大多数（但不是全部）蠕虫胴体溶解（图1）。注意：注意不要过度漂白蠕虫，因为这会破坏卵。某些突变可能会增加卵子分离的难度。 以716 x g 旋转1分钟。 一次倒出漂白剂溶液;只要此时管子不摇晃，卵就会粘在管子的一侧。 加入 15 mL 1x M9 缓冲液并转化。以716 x g 旋转1分钟，并以一个平滑的运动倒出M9缓冲液。 使用1x M9缓冲液总共进行三次洗涤，如步骤2.9中所述。 最终洗涤后，加入10mL新鲜1x M9，并在15°C下放在旋转器上过夜，以分离出饥饿的第一幼虫（L1）阶段动物的同步种群。注意：在放在旋转器上之前，请检查以确保M9缓冲液中有鸡蛋。如果没有，请用备用板重复准备，漂白时间更短。 3. 电镀同步秀丽隐杆线虫 （第2天） 打印出24孔板图并将菌株分配到随机位置。每个菌株应在24孔板中表示至少六次。 漂白剂制备后约24小时，在室温下在M9缓冲液中以716× g 离心下孵化饥饿的L1蠕虫1分钟。 用塑料转移移液器除去约9 mL的M9缓冲液，然后在剩余的M9缓冲液中轻轻混合饥饿的第一个幼虫期蠕虫（L1s）。 立即将M9缓冲液中的3μL蠕虫移液到显微镜载玻片上并确定L1的数量;所需数量为3μL中的20-30 L1s，如果蠕虫浓度太低，请向下旋转并除去M9，如果浓度过高，则加入M9。注意：检查每3μL至少2x的蠕虫数量，每次倒置管。 根据预制的板图（步骤3.1; 图 1）。注意：经常用M9中的L1s反转管子，以保持蠕虫的均匀分布，因为它们会沉降到底部。如果不这样做，一些井的蠕虫会太少，而另一些井的蠕虫会太多。此外，不要用移液器尖端刺穿琼脂，因为这会导致动物挖洞。 让蠕虫在20°C下生长到成年期3天。注意：使用不同的生长温度和某些突变会影响成熟速度，因此一定要考虑 秀丽隐杆线虫的 生命周期。 4. 进行左旋咪唑测定（第5天） 打印一个空白数据表，该数据表将用于记录每5分钟在每个孔中移动的蠕虫数量，持续1小时。注意：学生将能够每5分钟最多数12口孔中的蠕虫。在第一个小时测定前12个孔，在随后的一小时内测定底部的12个孔。 检查24孔板中的蠕虫。使用标记，在任何有污染，饥饿或有太多蠕虫的孔（>40）的板盖上做一个“X”，这将使计数变得困难。 通过将200μL100mM左旋咪唑储备液加入50mL的1x M9来制作0.4mM左旋咪唑溶液。通过将240.76mg盐酸左旋咪唑溶解在10mL H 2 O中并将其储存在-20°C来制备100mM左旋咪唑储备液。注意：左旋咪唑必须在M9中稀释;在H2O中稀释会加速瘫痪。学生应戴手套。摄入高浓度的左旋咪唑是有毒的。 启动计时器，然后使用转移移液管，将1mL 0.4mM左旋咪唑加入前两个孔中，使动物自由游泳。继续向相邻孔中加入左旋咪唑，根据待测定孔的数量错开时间。注意：例如，如果测定10孔，将按以下方式加入左旋咪唑：时间0的孔1和2，1分钟后的孔3和4，2分钟后的孔5和6，3分钟后孔7和8，以及4分钟后的9和10。 在5分钟时，从第一口孔开始手动仅计算每个孔中移动蠕虫的数量，并将该数字记录在数据表上（图1）。可以使用计数器，但不需要计数器来准确确定移动蠕虫的数量。注意：学生需要密切关注计时器，因为在许多蠕虫瘫痪之前，他们有时会在早期时间点落后。可以调整时间点的数量，或者如果需要，可以在每个时间点检测更少的孔。 继续每5分钟计算每孔中移动蠕虫的数量，持续1小时。注意：浸入M9诱导在这个1小时测定过程中不断游泳运动，这消除了刺激蠕虫以评估瘫痪的需要（图2A）。暴露于0.4 mM左旋咪唑溶液引起时间依赖性麻痹，如停止游泳所观察到的那样;瘫痪的蠕虫无法恢复。 重复步骤 4.4.-4.6。对于板中其余的井。 在测定结束时，或在时间允许的情况下，记录每个孔中蠕虫的总数。 5. 数据分析 获取板图（步骤3.1）并记录对应于每个孔的应变。注意：由于收集的数据量很大，对数据的后续分析和讨论至少需要几个小时。 将数据输入电子表格，从每个孔中的蠕虫总数开始，并按基因型进行组织。 结合来自油井的数据，确定每个菌株在每个时间点移动的蠕虫数量。 使用这些数据在统计软件（材料表）中创建“生存曲线”，以直观地显示人群的时间依赖性瘫痪（图2B）。 制作一个数据表，使左侧列指示时间，后续列包含每个菌株的数据。对于在前5分钟内瘫痪的每种动物，创建一排并输入“1”5分钟。对每个时间点重复此操作。对于在测定结束时不瘫痪的所有动物，输入“0”60分钟。 使用统计软件（材料表）中的对数秩（Mantel-Cox）检验进行成对比较，以确定两个不同菌株之间是否存在统计显著性差异。 对于附加/替代分析，而不是执行步骤 5.3。和步骤5.4.，确定每个时间点在每个孔中移动的动物的百分比。绘制使用电子表格程序或统计软件测定的所有菌株在每个时间点的标准误差的平均值（图2C）。