Spettrometria di massa a scambio idrogeno/deuterio al millisecondo per lo studio della dinamica strutturale dell'alfa-sinucleina in condizioni fisiologiche

Il morbo di Parkinson (PD) è una malattia neurodegenerativa che colpisce milioni di persone in tutto il mondo¹. È caratterizzato dalla formazione di inclusioni citoplasmatiche note come corpi di Lewy e neuriti di Lewy nella regione della substantia nigra pars compacta del cervello. Queste inclusioni citoplasmatiche sono state trovate per contenere aggregati della proteina intrinsecamente disordinata aSyn². Nel PD e in altre sinucleinopatie, aSyn si trasforma da uno stato disordinato solubile in uno stato malato insolubile e altamente strutturato. Nella sua forma nativa, l’aSyn monomerico adotta una vasta gamma di conformazioni stabilizzate da interazioni elettrostatiche a lungo raggio tra i suoi N- e C-termini e interazioni idrofobiche tra la sua regione C-terminus e la componente beta non amiloide (NAC) 3,4,5,6. Eventuali interruzioni in queste interazioni stabilizzanti, come mutazioni, modifiche post-traduzionali e cambiamenti nell’ambiente locale, possono portare al misfolding del monomero, innescando così il processo di aggregazione⁷.

Mentre esiste una grande quantità di ricerche sulle forme oligomeriche e fibrillari di aSyn 8,9,10,11, c’è un bisogno cruciale di studiare la forma monomerica della proteina e capire meglio quali conformisti sono funzionali (e come) e quali sono inclini ad aggregare 8,9,10,11 . Essendo intrinsecamente disordinato, solo 14 kDa di dimensioni e difficile da cristallizzare, il monomero aSyn non è suscettibile alla maggior parte delle tecniche biologiche strutturali. Tuttavia, una tecnica in grado di misurare la dinamica conformazionale di aSyn monomerico è millisecondo HDX-MS, che ha recentemente generato importanti osservazioni strutturali che sarebbero difficili o impossibili da ottenere altrimenti 12,13,14. Millisecond HDX-MS misura sensibilmente la media dell’insieme conformazionale proteico monitorando lo scambio isotopico a idrogeno ammidico, indicando l’accessibilità al solvente e la partecipazione alla rete di legame a idrogeno di una particolare regione proteica sulla scala temporale del millisecondo. È necessario sottolineare l’aspetto millisecondo dell’HDX-MS poiché, a causa della sua natura meta-stabile e dispiegata nativamente, aSyn presenta una cinetica di scambio idrogeno molto veloce che si manifesta ben al di sotto del limite inferiore dei sistemi HDX-MS convenzionali. Ad esempio, la maggior parte della molecola aSyn ha completamente scambiato idrogeno per deuterio in condizioni intracellulari in meno di 1 s. Diversi laboratori hanno ora costruito strumentazione a miscelazione rapida; in questo caso, viene utilizzato un prototipo di strumento a flusso di spegnimento a miscelazione rapida in grado di eseguire HDX-MS con un tempo morto di 50 ms e una risoluzione temporale di 1 ms¹⁵. Mentre il millisecondo HDX-MS è stato recentemente molto importante nello studio di aSyn, è importante per studiare proteine / regioni intrinsecamente disordinate più ampiamente e un gran numero di proteine con loop / regioni che sono solo debolmente stabili. Ad esempio, farmaci peptidici (ad esempio, insulina; GLP-1/glucagone; tirzepatide) e le proteine di fusione peptidica (ad esempio, l’inibitore dell’HIV FN3-L35-T1144) sono i principali formati farmacologici in cui le informazioni strutturali e di stabilità in fase di soluzione possono essere un input critico per le decisioni di sviluppo del farmaco e, tuttavia, la porzione peptidica è spesso solo debolmente stabile e intrattabile da HDX-MS alla scala temporale dei secondi 16,17,18,19,20 . I metodi emergenti HDX-MS con etichettatura nei domini secondi/minuti hanno dimostrato di ricavare informazioni strutturali per i G-quadruplex del DNA, ma dovrebbe essere possibile estenderlo a strutture oligonucleotidiche più diverse mediante l’applicazione di HDX-MS²¹ al millisecondo.

Gli esperimenti HDX-MS possono essere eseguiti a tre diversi livelli: (1) bottom-up (per cui la proteina etichettata viene digerita proteoliticamente), (2) middle-down (in cui la proteina etichettata viene digerita proteoliticamente e i peptidi risultanti vengono ulteriormente frammentati da tecniche di soft-fragmentation) e (3) top-down (per cui le tecniche di soft-fragmentation frammentano direttamente la proteina etichettata)²² . Pertanto, i dati sub-molecolari HDX-MS ci consentono di localizzare il comportamento di scambio in regioni specifiche di una proteina, rendendo fondamentale avere un’adeguata copertura della sequenza per tali esperimenti. La risoluzione strutturale di qualsiasi esperimento HDX-MS si basa sul numero di peptidi proteolitici o frammenti derivati dalla proteina durante la digestione o la frammentazione morbida, rispettivamente. In ciascuno dei tre tipi di esperimento sopra descritti, il cambiamento nello scambio ammidico in ogni peptide / frammento è mappato sulla struttura primaria della proteina per indicare il comportamento delle regioni localizzate della proteina. Mentre la massima risoluzione strutturale è raggiunta attraverso la frammentazione morbida, la descrizione di questi esperimenti è fuori dallo scopo del presente studio, che si concentra sulla misurazione delle conformazioni monomeriche aSyn. Risultati eccellenti possono essere ottenuti con il flusso di lavoro “bottom-up” comunemente applicato descritto qui.

Qui vengono fornite procedure su (1) come preparare e gestire campioni aSyn e buffer HDX-MS, (2) come eseguire la mappatura peptidica per un esperimento HDX-MS bottom-up, (3) come acquisire dati HDX-MS su aSyn monomerico in condizioni fisiologiche, in particolare nel dominio del tempo millisecondo (utilizzando uno strumento personalizzato; sono stati descritti anche strumenti alternativi per l’etichettatura dei millisecondi), e (4) come elaborare e analizzare i dati HDX-MS. I metodi che utilizzano aSyn monomerico a pH fisiologico (7.40) in due condizioni di soluzione sono esemplificati qui. Sebbene siano di fondamentale utilità nello studio di aSyn, queste procedure possono essere applicate a qualsiasi proteina e non sono limitate alle proteine intrinsecamente disordinate.