Spectrométrie de masse à échange hydrogène/deutérium milliseconde pour l’étude de la dynamique structurelle de l’alpha-synucléine dans des conditions physiologiques

La maladie de Parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative qui touche des millions de personnes dans le monde¹. Elle se caractérise par la formation d’inclusions cytoplasmiques connues sous le nom de corps de Lewy et de neurites de Lewy dans la région de la substantia nigra pars compacta du cerveau. Ces inclusions cytoplasmiques contiennent des agrégats de la protéine intrinsèquement désordonnée aSyn². Dans la MP et d’autres synucléinopathies, aSyn se transforme d’un état désordonné soluble en un état malade insoluble et hautement structuré. Dans sa forme native, l’aSyn monomère adopte une large gamme de conformations stabilisées par des interactions électrostatiques à longue portée entre ses N- et C-termini et des interactions hydrophobes entre son terminus C et sa région NAC (NAC) 3,4,5,6. Toute perturbation de ces interactions stabilisatrices, telles que les mutations, les modifications post-traductionnelles et les changements dans l’environnement local, peut conduire à un mauvais repliement du monomère, déclenchant ainsi le processus d’agrégation⁷.

Bien qu’il existe une grande quantité de recherches sur les formes oligomères et fibrillaires ^d’aSyn 8,9,10,11, il est crucial d’étudier la forme monomère de la protéine et de mieux comprendre quels conformateurs sont fonctionnels (et comment) et lesquels sont sujets à ^{l’agrégation} 8,9,10,11 . Étant intrinsèquement désordonné, de seulement 14 kDa et difficile à cristalliser, le monomère aSyn ne se prête pas à la plupart des techniques biologiques structurelles. Cependant, une technique capable de mesurer la dynamique conformationnelle de l’aSyn monomère est la milliseconde HDX-MS, qui a récemment généré d’importantes observations structurelles qui seraient difficiles ou impossibles à obtenir autrement 12,13,14. Milliseconde HDX-MS mesure avec sensibilité la moyenne de l’ensemble conformationnel protéique en surveillant l’échange isotopique au niveau des hydrogènes amides, indiquant l’accessibilité au solvant et la participation au réseau de liaison hydrogène d’une région protéique particulière sur l’échelle de temps de la milliseconde. Il est nécessaire de souligner l’aspect milliseconde du HDX-MS car, en raison de sa nature méta-stable et dépliée nativement, aSyn présente une cinétique d’échange d’hydrogène très rapide qui se manifeste bien en dessous de la limite inférieure des systèmes HDX-MS conventionnels. Par exemple, la majeure partie de la molécule aSyn a complètement échangé de l’hydrogène contre du deutérium dans des conditions intracellulaires en moins de 1 s. Plusieurs laboratoires ont maintenant construit des instruments à mélange rapide; dans ce cas, un prototype d’instrument à flux de trempe à mélange rapide capable d’effectuer HDX-MS avec un temps mort de 50 ms et une résolution temporelle de 1 ms est utilisé¹⁵. Bien que la milliseconde HDX-MS ait récemment été extrêmement importante dans l’étude d’aSyn, elle est précieuse pour étudier plus largement les protéines /régions intrinsèquement désordonnées et un grand nombre de protéines dont les boucles / régions ne sont que faiblement stables. Par exemple, les médicaments peptidiques (p. ex., l’insuline; GLP-1/glucagon; tirzépatide) et les protéines de fusion peptidique (par exemple, l’inhibiteur du VIH FN3-L35-T1144) sont des formats de médicaments majeurs où les informations structurelles et de stabilité en phase de solution peuvent être un intrant critique pour les décisions de développement de médicaments, et, pourtant, la fraction peptidique n’est souvent que faiblement stable et intraitable par HDX-MS à l’échelle de temps^{de seconde 16,17,18,19,20} . Il a été démontré que les méthodes émergentes HDX-MS avec marquage dans les domaines secondes/minutes dérivent des informations structurelles pour les quadruplex G de l’ADN, mais il devrait être possible de les étendre à des structures oligonucléotidiques plus diverses par l’application de HDX-MS²¹ millisecondes.

Les expériences HDX-MS peuvent être réalisées à trois niveaux différents : (1) ascendant (où la protéine marquée est digérée protéolytiquement), (2) intermédiaire (où la protéine marquée est digérée protéolytiquement, et les peptides résultants sont fragmentés davantage par des techniques de fragmentation douce), et (3) descendant (où les techniques de fragmentation douce fragmentent directement la protéine marquée)²² . Ainsi, les données hdX-MS sous-moléculaires nous permettent de localiser le comportement d’échange dans des régions spécifiques d’une protéine, ce qui rend essentiel d’avoir une couverture de séquence adéquate pour de telles expériences. La résolution structurelle de toute expérience HDX-MS repose sur le nombre de peptides protéolytiques ou de fragments dérivés de la protéine lors de la digestion ou de la fragmentation douce, respectivement. Dans chacun des trois types d’expériences décrits ci-dessus, le changement d’échange d’amide à chaque peptide / fragment est mappé sur la structure primaire de la protéine pour indiquer le comportement des régions localisées de la protéine. Bien que la résolution structurelle la plus élevée soit obtenue par fragmentation douce, la description de ces expériences est hors du cadre de la présente étude, qui se concentre sur la mesure des conformations de monomères aSyn. D’excellents résultats peuvent être obtenus avec le flux de travail « ascendant » couramment appliqué décrit ici.

Ici, des procédures sont fournies sur (1) comment préparer et manipuler des échantillons aSyn et des tampons HDX-MS, (2) comment effectuer une cartographie peptidique pour une expérience HDX-MS ascendante, (3) comment acquérir des données HDX-MS sur aSyn monomère dans des conditions physiologiques, en particulier dans le domaine temporel milliseconde (en utilisant un instrument personnalisé; des instruments alternatifs pour le marquage milliseconde ont également été décrits), et (4) comment traiter et analyser les données HDX-MS. Les méthodes utilisant l’aSyn monomère à pH physiologique (7,40) dans deux conditions de solution sont illustrées ici. Bien qu’elles soient d’une utilité critique dans l’étude d’aSyn, ces procédures peuvent être appliquées à n’importe quelle protéine et ne se limitent pas aux protéines intrinsèquement désordonnées.