Millisekund hydrogen / deuterium-utveksling massespektrometri for studiet av alfa-synuclein strukturell dynamikk under fysiologiske forhold

Parkinsons sykdom (PD) er en nevrodegenerativ sykdom som påvirker millioner av mennesker over hele verden¹. Det er preget av dannelsen av cytoplasmatiske inneslutninger kjent som Lewy-legemer og Lewy-neuritter i hjernens substantia nigra pars compacta-region. Disse cytoplasmatiske inneslutningene har vist seg å inneholde aggregater av det indre uordnede proteinet aSyn². I PD og andre synukleinopatier transformerer aSyn fra en løselig uordnet tilstand til en uoppløselig, svært strukturert syk tilstand. I sin opprinnelige form vedtar monomere aSyn et bredt spekter av konformasjoner stabilisert av langdistanse elektrostatiske interaksjoner mellom N- og C-termini og hydrofobe interaksjoner mellom C-terminalen og ikke-amyloid beta-komponent (NAC) region 3,4,5,6. Eventuelle forstyrrelser i de stabiliserende interaksjonene, for eksempel mutasjoner, posttranslasjonelle modifikasjoner og endringer i det lokale miljøet, kan føre til feilfolding av monomeren, og dermed utløse prosessen med aggregering⁷.

Mens det finnes en enorm mengde forskning på oligomere og fibrillære former av aSyn ^8,9,10,11, er det et avgjørende behov for å studere proteinets monomere form og bedre forstå hvilke konformatorer som er funksjonelle (og hvordan) og hvilke som er tilbøyelige til å samle ^8,9,10,11 . Å være iboende uordnet, bare 14 kDa i størrelse og vanskelig å krystallisere, er aSyn-monomeren ikke mottagelig for de fleste strukturelle biologiske teknikker. Imidlertid er en teknikk som er i stand til å måle konformasjonsdynamikken til monomer aSyn millisekund HDX-MS, som nylig har generert viktige strukturelle observasjoner som ville være utfordrende eller umulig å oppnå ellers 12,13,14. Millisekund HDX-MS måler følsomt gjennomsnittet av proteinkonformasjonsensemblet ved å overvåke isotoputvekslingen ved amidhydrogensere, noe som indikerer løsemiddeltilgjengelighet og hydrogenbindingsnettverksdeltakelse av et bestemt proteinområde på millisekundets tidsskala. Det er nødvendig å understreke millisekundaspektet av HDX-MS, da aSyn på grunn av sin opprinnelig utfoldede, metastabile natur utviser veldig rask hydrogenutvekslingskinetikk som manifesterer seg godt under den nedre grensen for konvensjonelle HDX-MS-systemer. For eksempel har det meste av aSyn-molekylet fullstendig utvekslet hydrogen for deuterium under intracellulære forhold på mindre enn 1 s. Flere laboratorier har nå bygget hurtigblande instrumentering; i dette tilfellet brukes et prototype raskt blandende slukkeflytinstrument som er i stand til å utføre HDX-MS med en dødtid på 50 ms og en tidsmessig oppløsning på 1 ms¹⁵. Mens millisekund HDX-MS nylig har vært akutt viktig i studiet av aSyn, står det å være verdifullt for å studere iboende uordnede proteiner / regioner i større grad og et stort antall proteiner med løkker / regioner som bare er svakt stabile. For eksempel, peptidmedikamenter (f.eks. insulin; GLP-1/glukagon; tirzepatid) og peptidfusjonsproteiner (f.eks. HIV-hemmeren FN3-L35-T1144) er viktige legemiddelformater der struktur- og stabilitetsinformasjon i løsningsfasen kan være en kritisk inngang for beslutninger om legemiddelutvikling, og likevel er peptiddelen ofte bare svakt stabil og ugjennomtrengelig av HDX-MS på sekundene tidsskala 16,17,18,19,20 . Emergent HDX-MS metoder med merking i sekunder / minutter domener har vist seg å utlede strukturell informasjon for DNA G-quadruplexes, men det bør være mulig å utvide dette til mer variert oligonukleotid strukturer ved anvendelse av millisekund HDX-MS²¹.

HDX-MS-eksperimenter kan utføres på tre forskjellige nivåer: (1) bottom-up (hvor det merkede proteinet fordøyes proteolytisk), (2) middle-down (hvorved det merkede proteinet fordøyes proteolytisk, og de resulterende peptidene fragmenteres ytterligere ved myke fragmenteringsteknikker), og (3) top-down (hvorved myke fragmenteringsteknikker direkte fragmenterer det merkede proteinet)²² . Dermed tillater submolekylære HDX-MS-data oss å lokalisere utvekslingsadferden til bestemte regioner av et protein, noe som gjør det kritisk å ha tilstrekkelig sekvensdekning for slike eksperimenter. Den strukturelle oppløsningen til ethvert HDX-MS-eksperiment er avhengig av antall proteolytiske peptider eller fragmenter avledet fra proteinet ved fordøyelse eller myk fragmentering, henholdsvis. I hver av de tre eksperimenttypene som er skissert ovenfor, kartlegges endringen i amidutveksling ved hvert peptid / fragment tilbake på proteinets primære struktur for å indikere oppførselen til lokaliserte regioner av proteinet. Mens den høyeste strukturelle oppløsningen oppnås gjennom myk fragmentering, er beskrivelsen av disse eksperimentene utenfor omfanget av den nåværende studien, som fokuserer på måling av aSyn-monomerkonformasjoner. Utmerkede resultater kan oppnås med den ofte brukte “bottom-up” arbeidsflyten som er beskrevet her.

Her er det gitt prosedyrer for (1) hvordan man preparerer og håndterer aSyn-prøver og HDX-MS-buffere, (2) hvordan man utfører peptidkartlegging for et bottom-up HDX-MS-eksperiment, (3) hvordan man skaffer HDX-MS-data om monomere aSyn under fysiologiske forhold, spesielt i millisekund-tidsdomenet (ved hjelp av et spesialbygd instrument; alternative instrumenter for millisekundmerking er også beskrevet), og (4) hvordan du behandler og analyserer HDX-MS-dataene. Metoder som bruker monomer aSyn ved fysiologisk pH (7,40) i to løsningsforhold er eksemplifisert her. Selv om det er kritisk nyttig i studiet av aSyn, kan disse prosedyrene brukes på ethvert protein og er ikke begrenset til egentlig uordnede proteiner.