Milliseconde waterstof/deuterium-uitwisseling massaspectrometrie voor de studie van alfa-synucleïne structurele dynamica onder fysiologische omstandigheden

De ziekte van Parkinson (PD) is een neurodegeneratieve ziekte die wereldwijd miljoenen mensen treft¹. Het wordt gekenmerkt door de vorming van cytoplasmatische insluitsels bekend als Lewy bodies en Lewy neurites in de substantia nigra pars compacta regio van de hersenen. Deze cytoplasmatische insluitsels blijken aggregaten van het intrinsiek ongeordende eiwit aSyn² te bevatten. Bij PD en andere synucleinopathieën transformeert aSyn van een oplosbare ongeordende toestand in een onoplosbare, sterk gestructureerde zieke toestand. In zijn oorspronkelijke vorm neemt monomere aSyn een breed scala aan conformaties aan, gestabiliseerd door elektrostatische interacties op lange afstand tussen zijn N- en C-termini en hydrofobe interacties tussen zijn C-terminus en niet-amyloïde bètacomponent (NAC) regio 3,4,5,6. Eventuele verstoringen in die stabiliserende interacties, zoals mutaties, posttranslationele modificaties en veranderingen in de lokale omgeving, kunnen leiden tot het verkeerd vouwen van het monomeer, waardoor het proces van aggregatie^{wordt geactiveerd 7}.

Hoewel er een enorme hoeveelheid onderzoek bestaat naar de oligomere en fibrillaire vormen van aSyn 8,9,10,11, is er een cruciale behoefte om de monomere vorm van het eiwit te bestuderen en beter te begrijpen welke conformers functioneel zijn (en hoe) en welke vatbaar zijn voor aggregaat 8,9,10,11 . Omdat het intrinsiek ongeordend is, slechts 14 kDa groot is en moeilijk te kristalliseren, is het aSyn-monomeer niet vatbaar voor de meeste structurele biologische technieken. Een techniek die in staat is om de conformatiedynamiek van monomere aSyn te meten, is milliseconde HDX-MS, die onlangs belangrijke structurele waarnemingen heeft gegenereerd die uitdagend of onmogelijk te verkrijgen zouden zijn anders 12,13,14. Milliseconde HDX-MS meet gevoelig het gemiddelde van het eiwitconformatie-ensemble door de isotopische uitwisseling bij amidewaterstoffen te monitoren, wat wijst op de toegankelijkheid van oplosmiddelen en de deelname van het waterstofbindingsnetwerk van een bepaald eiwitgebied op de millisecondetijdschaal. Het is noodzakelijk om het milliseconde-aspect van de HDX-MS te benadrukken, omdat aSyn, vanwege zijn native uitgevouwen, meta-stabiele aard, een zeer snelle waterstofuitwisselingskinetiek vertoont die zich ver onder de ondergrens van conventionele HDX-MS-systemen manifesteert. Het grootste deel van het aSyn-molecuul heeft bijvoorbeeld waterstof volledig uitgewisseld voor deuterium onder intracellulaire omstandigheden in minder dan 1 s. Verschillende laboratoria hebben inmiddels snelmenginstrumenten gebouwd; in dit geval wordt een prototype snel mengend quench-flow instrument gebruikt dat HDX-MS kan uitvoeren met een dead-time van 50 ms en een temporele resolutie van 1 ms¹⁵. Hoewel milliseconde HDX-MS onlangs acuut belangrijk is geweest in de studie van aSyn, is het waardevol bij het bestuderen van intrinsiek ongeordende eiwitten / regio’s op grotere schaal en een groot aantal eiwitten met lussen / regio’s die slechts zwak stabiel zijn. Bijvoorbeeld peptidegeneesmiddelen (bijv. Insuline; GLP-1/glucagon; tirzepatide) en peptidefusie-eiwitten (bijv. de HIV-remmer FN3-L35-T1144) zijn belangrijke medicijnformaten waarbij structurele en stabiliteitsinformatie in de oplossingsfase een kritische input kan zijn voor beslissingen over de ontwikkeling van geneesmiddelen, en toch is het peptidegedeelte vaak slechts zwak stabiel en onhandelbaar door HDX-MS op de secondentijdschaal 16,17,18,19,20 . Van opkomende HDX-MS-methoden met labeling in de seconden/minuten-domeinen is aangetoond dat ze structurele informatie afleiden voor DNA G-quadruplexen, maar het zou mogelijk moeten zijn om dit uit te breiden naar meer diverse oligonucleotidestructuren door de toepassing van milliseconde HDX-MS²¹.

HDX-MS-experimenten kunnen op drie verschillende niveaus worden uitgevoerd: (1) bottom-up (waarbij het gelabelde eiwit proteolytisch wordt verteerd), (2) middle-down (waarbij het gelabelde eiwit proteolytisch wordt verteerd en de resulterende peptiden verder worden gefragmenteerd door soft-fragmentation technieken), en (3) top-down (waarbij soft-fragmentation technieken het gelabelde eiwit direct fragmenteren)²² . Submoleculaire HDX-MS-gegevens stellen ons dus in staat om het uitwisselingsgedrag te lokaliseren naar specifieke regio’s van een eiwit, waardoor het van cruciaal belang is om voldoende sequentiedekking voor dergelijke experimenten te hebben. De structurele resolutie van elk HDX-MS-experiment is afhankelijk van het aantal proteolytische peptiden of fragmenten afgeleid van het eiwit bij vertering of zachte fragmentatie, respectievelijk. In elk van de drie hierboven beschreven experimenttypen wordt de verandering in amide-uitwisseling bij elk peptide / fragment teruggekoppeld naar de primaire structuur van het eiwit om het gedrag van gelokaliseerde gebieden van het eiwit aan te geven. Hoewel de hoogste structurele resolutie wordt bereikt door zachte fragmentatie, valt de beschrijving van deze experimenten buiten het bereik van de huidige studie, die zich richt op het meten van aSyn monomeer conformaties. Uitstekende resultaten kunnen worden verkregen met de vaak toegepaste “bottom-up” workflow die hier wordt beschreven.

Hier worden procedures gegeven over (1) hoe aSyn-monsters en HDX-MS-buffers te bereiden en te verwerken, (2) hoe peptidemapping uit te voeren voor een bottom-up HDX-MS-experiment, (3) hoe HDX-MS-gegevens over monomere aSyn te verkrijgen onder fysiologische omstandigheden, met name in het millisecondetijddomein (met behulp van een op maat gemaakt instrument; alternatieve instrumenten voor milliseconde-etikettering zijn ook beschreven), en (4) hoe de HDX-MS-gegevens te verwerken en te analyseren. Methoden met behulp van monomere aSyn bij fysiologische pH (7,40) in twee oplossingsomstandigheden worden hier geïllustreerd. Hoewel kritisch nuttig in de studie van aSyn, kunnen deze procedures worden toegepast op elk eiwit en zijn ze niet beperkt tot intrinsiek ongeordende eiwitten.