Det strukturelle ensemble af monomer alfa-synuclein påvirker dets fysiologiske funktion og fysisk-kemiske egenskaber. Denne protokol beskriver, hvordan man udfører millisekund hydrogen/ deuteriumudvekslingsmassespektrometri og efterfølgende dataanalyser for at bestemme konformationsoplysninger om monomeren af dette iboende uordnede protein under fysiologiske forhold.
Alfa-synuclein (aSyn) er et iboende uordnet protein, hvis fibrillære aggregater er rigelige i Lewy-kroppe og neuritter, som er kendetegnende for Parkinsons sygdom. Alligevel involverer meget af dets biologiske aktivitet såvel som dets aggregering centralt den opløselige monomerform af proteinet. Belysning af de molekylære mekanismer i aSyn biologi og patofysiologi kræver strukturelt stærkt opløste metoder og er følsom over for biologiske forhold. Dens naturligt udfoldede, metastabile strukturer gør monomer aSyn uhåndterlig for mange strukturelle biologiske teknikker. Her beskrives anvendelsen af en sådan tilgang: hydrogen/deuterium-udvekslingsmassespektrometri (HDX-MS) på millisekundets tidsskala for undersøgelse af proteiner med lav termodynamisk stabilitet og svage beskyttelsesfaktorer, såsom aSyn. På millisekundets tidsskala indeholder HDX-MS-data oplysninger om opløsningsmiddeltilgængelighed og hydrogenbundet struktur af aSyn, som går tabt på længere mærkningstider, hvilket i sidste ende giver strukturel opløsning op til aminosyreniveauet. Derfor kan HDX-MS give information ved høje strukturelle og tidsmæssige opløsninger om konformationsdynamik og termodynamik, intra- og intermolekylære interaktioner og den strukturelle virkning af mutationer eller ændringer i miljøforhold. Selvom det er bredt anvendeligt, demonstreres det, hvordan man erhverver, analyserer og fortolker millisekund HDX-MS-målinger i monomerisk aSyn.
Parkinsons sygdom (PD) er en neurodegenerativ sygdom, der påvirker millioner af mennesker over hele verden1. Det er kendetegnet ved dannelsen af cytoplasmatiske indeslutninger kendt som Lewy-kroppe og Lewy-neuritter i hjernens substantia nigra pars compacta-region. Disse cytoplasmatiske indeslutninger har vist sig at indeholde aggregater af det iboende uordnede protein aSyn2. I PD og andre synukleinopatier omdannes aSyn fra en opløselig uordnet tilstand til en uopløselig, stærkt struktureret syg tilstand. I sin oprindelige form vedtager monomer aSyn en bred vifte af konformationer stabiliseret af langtrækkende elektrostatiske interaktioner mellem dets N- og C-termini og hydrofobe interaktioner mellem dets C-endestation og ikke-amyloid beta-komponent (NAC) region 3,4,5,6. Eventuelle forstyrrelser i disse stabiliserende interaktioner, såsom mutationer, posttranslationelle modifikationer og ændringer i det lokale miljø, kan føre til fejlfoldning af monomeren og dermed udløse aggregeringsprocessen7.
Mens der findes en enorm mængde forskning om de oligomere og fibrillarformer af aSyn 8,9,10,11, er der et afgørende behov for at studere den monomere form af proteinet og bedre forstå, hvilke konforme der er funktionelle (og hvordan), og hvilke der er tilbøjelige til at aggregere 8,9,10,11 . At være iboende uordnet, kun 14 kDa i størrelse og vanskelig at krystallisere, er aSyn monomeren ikke modtagelig for de fleste strukturelle biologiske teknikker. En teknik, der er i stand til at måle konformationsdynamikken i monomer aSyn, er imidlertid millisekund HDX-MS, som for nylig har genereret vigtige strukturelle observationer, der ville være udfordrende eller umulige at opnå ellers 12,13,14. Millisekunder HDX-MS måler følsomt gennemsnittet af proteinkonformationsensemblet ved at overvåge isotopudvekslingen ved amidhydrogener, hvilket indikerer opløsningsmiddeltilgængelighed og hydrogenbindingsnetværksdeltagelse for et bestemt proteinområde på millisekundets tidsskala. Det er nødvendigt at understrege millisekundaspektet af HDX-MS, da aSyn på grund af sin naturligt udfoldede, metastabile natur udviser meget hurtig hydrogenudvekslingskinetik, der manifesterer sig langt under den nedre grænse for konventionelle HDX-MS-systemer. For eksempel har det meste af aSyn-molekylet fuldstændigt udvekslet hydrogen til deuterium under intracellulære forhold på mindre end 1 s. Flere laboratorier har nu bygget hurtigblandingsinstrumentering; i dette tilfælde anvendes et prototype hurtigblandende slukningsflowinstrument, der er i stand til at udføre HDX-MS med en dødtid på 50 ms og en tidsmæssig opløsning på 1 ms15. Mens millisekund HDX-MS for nylig har været akut vigtig i studiet af aSyn, står det til at være værdifuldt at studere iboende uordnede proteiner / regioner mere bredt og et stort antal proteiner med sløjfer / regioner, der kun er svagt stabile. For eksempel peptidlægemidler (f.eks. Insulin; GLP-1/glukagon; tirzepatid) og peptidfusionsproteiner (f.eks. HIV-hæmmeren FN3-L35-T1144) er vigtige lægemiddelformater, hvor opløsningsfasestruktur- og stabilitetsoplysninger kan være et kritisk input til beslutninger om lægemiddeludvikling, og alligevel er peptiddelen ofte kun svagt stabil og uhåndterlig af HDX-MS på sekundernes tidsskala 16,17,18,19,20 . Emergent HDX-MS-metoder med mærkning i sekunder / minutter domæner har vist sig at udlede strukturelle oplysninger for DNA G-quadruplexes, men det skulle være muligt at udvide dette til mere forskellige oligonukleotidstrukturer ved anvendelse af millisekund HDX-MS21.
HDX-MS-eksperimenter kan udføres på tre forskellige niveauer: (1) bottom-up (hvorved det mærkede protein fordøjes proteolytisk), (2) middle-down (hvorved det mærkede protein fordøjes proteolytisk, og de resulterende peptider fragmenteres yderligere ved hjælp af bløde fragmenteringsteknikker) og (3) top-down (hvorved bløde fragmenteringsteknikker direkte fragmenterer det mærkede protein)22 . Således giver submolekylære HDX-MS-data os mulighed for at lokalisere udvekslingsadfærden til bestemte regioner af et protein, hvilket gør det kritisk at have tilstrækkelig sekvensdækning for sådanne eksperimenter. Den strukturelle opløsning af ethvert HDX-MS-eksperiment afhænger af antallet af proteolytiske peptider eller fragmenter afledt af proteinet ved henholdsvis fordøjelse eller blød fragmentering. I hver af de tre eksperimenttyper, der er skitseret ovenfor, kortlægges ændringen i amidudveksling ved hvert peptid / fragment tilbage på proteinets primære struktur for at indikere opførsel af lokaliserede regioner af proteinet. Mens den højeste strukturelle opløsning opnås gennem blød fragmentering, er beskrivelsen af disse eksperimenter uden for rammerne af den nuværende undersøgelse, der fokuserer på måling af aSyn monomer konformationer. Fremragende resultater kan opnås med den almindeligt anvendte “bottom-up” arbejdsgang beskrevet her.
Her gives procedurer for (1) hvordan man forbereder og håndterer aSyn-prøver og HDX-MS-buffere, (2) hvordan man udfører peptidkortlægning til et bottom-up HDX-MS-eksperiment, (3) hvordan man erhverver HDX-MS-data om monomere aSyn under fysiologiske forhold, specifikt i millisekundets tidsdomæne (ved hjælp af et specialbygget instrument; alternative instrumenter til millisekundmærkning er også beskrevet), og (4) hvordan man behandler og analyserer HDX-MS-dataene. Metoder, der anvender monomer aSyn ved fysiologisk pH (7,40) i to opløsningsbetingelser, er eksemplificeret her. Selvom de er kritisk nyttige i undersøgelsen af aSyn, kan disse procedurer anvendes på ethvert protein og er ikke begrænset til iboende uordnede proteiner.
I denne artikel beskrives følgende procedurer: (1) udførelse af peptidkortlægningseksperimenter på monomer aSyn for at opnå den højeste sekvensdækning, (2) erhvervelse af millisekunder HDX-MS-data på monomere aSyn under fysiologiske forhold og (3) udførelse af dataanalyse og fortolkning af de resulterende HDX-MS-data. De medfølgende procedurer er generelt enkle at udføre, hvert mærkningseksperiment varer typisk kun omkring 8 timer i tre replikater og otte tidspunkter, og kortlægningseksperimentet varer kun c…
The authors have nothing to disclose.
NS er finansieret af University Council Diamond Jubilee Scholarship. JJP støttes af et UKRI Future Leaders Fellowship [Tilskudsnummer: MR / T02223X / 1].
1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μm C18 column | Waters Corporation | 186002346 | Analytical column |
Acetonitrile HPLC grade >99.9% HiPerSolv | VWR | 20060.420 | For LC mobile phases |
CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670 | Salt for HDX buffers |
Chronos | Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation) | 667006090 | Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell |
Deuterium chloride | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-2-50 | For HDX labelling buffers |
Deuterium oxide (99.9% D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-4 | Deuterated water |
DynamX 3.0 | Waters Corporation | 176016027 | Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation |
Enzymate BEH Pepsin Column | Waters Corporation | 186007233 | Pepsin digestion column |
Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade | Fisher Scientific | 10596814 | For LC mobile phases |
Guanidinium hydrochloride | Sigma Aldrich | RDD001-500G | Chaotrope/Denaturant |
HDfleX | University of Exeter | N/A | https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982 |
KCl | Sigma Aldrich | P3911 | Salt for HDX buffers |
LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot | Waters Corporation | 725000637 | Autosampler robot |
Leucine enkephalin | Waters Corporation | 186006013 | For mass spectrometry lockspray calibration. |
MassLynx | Waters Corporation | 667004007 | Software controlling inlet methods and mass spectrometer |
Maximum recovery vials | Waters Corporation | 600000670CV | 100 pack including caps – used for quench tray in LEAP HDX-2 |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Salt for HDX buffers |
Millipore 0.22 µm syringe filters | Millipore | N9CA7069B | Syringe filters |
ms2min | Applied Photophysics Ltd | N/A | fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument |
NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | Salt for HDX buffers |
Peltier temperature controller | LEAP Technologies Inc. | HP115-COOL/D | Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot. |
ProteinLynx Global Server 3.0 | Waters Corporation | 715001030 | Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors. |
Reagent pot caps | Waters Corporation | 186004632 | 100 pack |
Reagent pots for LEAP HDX-2 | Waters Corporation | 186001420 | 100 pack excluding caps – used for buffers in LEAP HDX-2 |
Sodium deuteroxide (99.5% in D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-57 | For HDX labelling buffers |
Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO) | Amicon (Merck Sigma Aldrich) | UFC5003 | Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments. |
Synapt G2-Si mass spectrometer | Waters Corporation | 176850035 | Mass spectrometer |
Total recovery vials | Waters Corporation | 600000671CV | 100 pack including caps – used for labelling tray in LEAP HDX-2 |
Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253-250G | Buffer |
Trizma base | Sigma Aldrich | T60040-B2005 | Buffer |
Urea | Sigma Aldrich | U5378-1KG | Chaotrope/Denaturant |
VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column | Waters Corporation | 186004623 | Trap desalting column |