ספקטרומטריית מסות חילופי מימן/דאוטריום של אלפיות השנייה לחקר הדינמיקה המבנית של אלפא-סינוקלאין בתנאים פיזיולוגיים
Summary
ההרכב המבני של אלפא-סינוקלאין מונומרי משפיע על תפקודו הפיזיולוגי ועל תכונותיו הפיזיקוכימיות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד לבצע ספקטרומטריית מסות חילופי מימן/דאוטריום של אלפיות השנייה וניתוחי נתונים מאוחרים יותר כדי לקבוע מידע קונפורמי על המונומר של חלבון זה בעל הפרעה פנימית בתנאים פיזיולוגיים.
Abstract
אלפא-סינוקלאין (aSyn) הוא חלבון בעל הפרעה פנימית, שאגרגטי הפיברילאר שלו מצויים בשפע בגופי לוי ובנוייריטים, שהם סימני ההיכר של מחלת הפרקינסון. עם זאת, חלק גדול מהפעילות הביולוגית שלו, כמו גם הצבירה שלו, כוללים באופן מרכזי את צורת המונומר המסיסה של החלבון. הבהרת המנגנונים המולקולריים של הביולוגיה והפתופיזיולוגיה של aSyn דורשת שיטות פתורות מאוד מבחינה מבנית והיא רגישה לתנאים ביולוגיים. המבנים המטא-יציבים שלה, המתגלגלים באופן מקורי, הופכים את ה-aSyn המונומרי לבלתי ניתן לתיקון לטכניקות רבות של ביולוגיה מבנית. כאן מתואר היישום של גישה אחת כזו: ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן/דאוטריום (HDX-MS) על ציר הזמן של אלפית השנייה לחקר חלבונים עם יציבות תרמודינמית נמוכה וגורמי הגנה חלשים, כגון aSyn. בקנה מידה של אלפית השנייה, נתוני HDX-MS מכילים מידע על נגישות הממס ועל המבנה הקשור למימן של aSyn, אשר הולכים לאיבוד בזמני תיוג ארוכים יותר, ובסופו של דבר מניבים רזולוציה מבנית עד לרמת חומצות האמינו. לכן, HDX-MS יכול לספק מידע ברזולוציות מבניות וטמפורליות גבוהות על דינמיקה קונפורמציה ותרמודינמיקה, אינטראקציות תוך-מולקולריות ובין-מולקולריות, וההשפעה המבנית של מוטציות או שינויים בתנאים הסביבתיים. למרות שהוא ישים באופן נרחב, הוא מודגם כיצד לרכוש, לנתח ולפרש מדידות HDX-MS של אלפיות השנייה ב- aSyn מונומרי.
Introduction
מחלת פרקינסון (PD) היא מחלה נוירודגנרטיבית המשפיעה על מיליוני אנשים ברחבי העולם1. הוא מאופיין על ידי היווצרות של תכלילים ציטופלסמיים הידועים בשם גופי לוי ונויריטים לוי באזור substantia nigra pars compacta של המוח. תכלילים ציטופלסמיים אלה נמצאו כמכילים אגרגטים של החלבון aSyn2 בעל הפרעה פנימית. ב-PD ובסינוקלינופתיות אחרות, aSyn הופך ממצב של הפרעה מסיסה למצב מחלה בלתי מסיס ומובנה מאוד. בצורתו המקורית, aSyn מונומרית מאמצת מגוון רחב של קונפורמציות המיוצבות על ידי אינטראקציות אלקטרוסטטיות ארוכות טווח בין N ו-C-termini שלה לבין אינטראקציות הידרופוביות בין C-terminus שלה לבין רכיב בטא שאינו עמילואידי (NAC) באזור 3,4,5,6. כל שיבוש באותן אינטראקציות מייצבות, כגון מוטציות, שינויים לאחר תרגום ושינויים בסביבה המקומית, יכול להוביל לקיפול שגוי של המונומר, ובכך לעורר את תהליך הצבירה7.
בעוד שקיימת כמות עצומה של מחקר על הצורות האוליגומריות והפיברילאריות של aSyn 8,9,10,11, יש צורך מכריע לחקור את הצורה המונומרית של החלבון ולהבין טוב יותר אילו קונפורמרים מתפקדים (וכיצד) ואילו נוטים לצבור 8,9,10,11 . בהיותו בעל הפרעה פנימית, רק בגודל 14 kDa, וקשה להתגבש, המונומר aSyn אינו מקובל על רוב הטכניקות הביולוגיות המבניות. עם זאת, טכניקה אחת המסוגלת למדוד את הדינמיקה הקונפורמיונלית של aSyn מונומרית היא אלפית השנייה HDX-MS, אשר יצרה לאחרונה תצפיות מבניות חשובות שיהיו מאתגרות או בלתי אפשריות להשיג אחרת 12,13,14. אלפית השנייה HDX-MS מודדת ברגישות את הממוצע של ההרכב הקונפורמציה של החלבון על ידי ניטור ההחלפה האיזוטופית באמיד מימן, מה שמעיד על נגישות ממסים והשתתפות ברשת קשרי מימן של אזור חלבון מסוים על ציר הזמן של אלפית השנייה. יש צורך להדגיש את ההיבט של אלפית השנייה של HDX-MS שכן, בשל אופיו המטא-יציב, המתגלגל באופן מקורי, aSyn מציג קינטיקה מהירה מאוד של חילופי מימן המתבטאת הרבה מתחת לגבול התחתון של מערכות HDX-MS קונבנציונליות. לדוגמה, רוב מולקולת aSyn החליפה לחלוטין מימן עבור דאוטריום בתנאים תוך תאיים בפחות משנייה אחת. מספר מעבדות בנו כעת מכשור ערבוב מהיר; במקרה זה, אב טיפוס של מכשיר זרימת מרווה מהיר בערבוב מהיר המסוגל לבצע HDX-MS עם זמן מת של 50 אלפיות השנייה ורזולוציה זמנית של 1 אלפיות השנייה משמש15. בעוד אלפית השנייה HDX-MS היה לאחרונה חשוב מאוד במחקר של aSyn, זה עומד להיות בעל ערך בחקר חלבונים / אזורים מופרעים במהותם באופן נרחב יותר ומספר רב של חלבונים עם לולאות / אזורים שהם רק יציבים חלשה. לדוגמה, תרופות פפטידיות (למשל, אינסולין; GLP-1/גלוקגון; tirzepatide) וחלבוני היתוך פפטידים (למשל, מעכב ה- HIV FN3-L35-T1144) הם פורמטים עיקריים של תרופות שבהן מידע מבני ויציבות בשלב התמיסה יכול להיות קלט קריטי להחלטות פיתוח תרופות, ובכל זאת, הפפטיד מואטי הוא לעתים קרובות רק יציב חלש ובלתי ניתן לתיקון על ידי HDX-MS בלוח הזמנים של השניות 16,17,18,19,20 . שיטות HDX-MS מתפתחות עם תיוג בתחומים של שניות/דקות הוכחו כמפיקות מידע מבני עבור דנ”א G-quadxes, אך יש לאפשר להרחיב זאת למבנים אוליגונוקלאוטידים מגוונים יותר על ידי יישום של אלפית השנייה HDX-MS21.
ניסויי HDX-MS יכולים להתבצע בשלוש רמות שונות: (1) מלמטה למעלה (לפיה החלבון המסומן מתעכל באופן פרוטאוליטי), (2) אמצע-מטה (לפיו החלבון המסומן מתעכל באופן פרוטאוליטי, והפפטידים המתקבלים מקוטעים עוד יותר על ידי טכניקות פיצול רך), ו-(3) מלמעלה למטה (לפיהם טכניקות פיצול רך מפרקות ישירות את החלבון המסומן)22 . לפיכך, נתוני HDX-MS תת-מולקולריים מאפשרים לנו להתאים את התנהגות החליפין לאזורים ספציפיים של חלבון, מה שהופך את זה לחיוני שיהיה כיסוי רצפים הולם לניסויים כאלה. הרזולוציה המבנית של כל ניסוי HDX-MS מסתמכת על מספר הפפטידים או השברים הפרוטאוליטיים שמקורם בחלבון בעת העיכול או בפיצול רך, בהתאמה. בכל אחד משלושת סוגי הניסויים שתוארו לעיל, השינוי בחילופי האמיד בכל פפטיד/מקטע ממופה בחזרה למבנה הראשוני של החלבון כדי להצביע על התנהגותם של אזורים מקומיים של החלבון. בעוד שהרזולוציה המבנית הגבוהה ביותר מושגת באמצעות פיצול רך, התיאור של ניסויים אלה הוא מחוץ לתחום המחקר הנוכחי, המתמקד במדידת קונפורמציות מונומר aSyn. תוצאות מצוינות ניתן להשיג עם זרימת העבודה הנפוצה “מלמטה למעלה” המתוארת כאן.
כאן, ניתנים נהלים על (1) כיצד להכין ולטפל בדגימות aSyn ובמאגרי HDX-MS, (2) כיצד לבצע מיפוי פפטידים עבור ניסוי HDX-MS מלמטה למעלה, (3) כיצד לרכוש נתוני HDX-MS על aSyn מונומרי בתנאים פיזיולוגיים, במיוחד בתחום הזמן של אלפית השנייה (באמצעות מכשיר שנבנה בהתאמה אישית; תוארו גם מכשירים חלופיים לתיוג אלפיות השנייה), וכן (4) כיצד לעבד ולנתח את נתוני HDX-MS. שיטות המשתמשות ב- aSyn מונומרי ב- pH פיזיולוגי (7.40) בשני מצבי תמיסה מודגמות כאן. למרות שהם שימושיים באופן קריטי במחקר של aSyn, הליכים אלה יכולים להיות מיושמים על כל חלבון ואינם מוגבלים לחלבונים עם הפרעה פנימית.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר הנוכחי מתוארים ההליכים הבאים: (1) ביצוע ניסויי מיפוי פפטידים על aSyn מונומרי כדי לקבל את כיסוי הרצף הגבוה ביותר, (2) רכישת נתוני HDX-MS של אלפיות השנייה על aSyn מונומרי בתנאים פיזיולוגיים, ו-(3) ביצוע ניתוח נתונים ופרשנות של נתוני HDX-MS המתקבלים. ההליכים המסופקים הם בדרך כלל פשוטים לביצוע, כל ניסו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NS ממומן על ידי מלגת יובל היהלומים של מועצת האוניברסיטה. JJP נתמך על ידי מלגת מנהיגי העתיד של UKRI [מספר מענק: MR/T02223X/1].
Materials
| 1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μm C18 column | Waters Corporation | 186002346 | Analytical column |
| Acetonitrile HPLC grade >99.9% HiPerSolv | VWR | 20060.420 | For LC mobile phases |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670 | Salt for HDX buffers |
| Chronos | Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation) | 667006090 | Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell |
| Deuterium chloride | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-2-50 | For HDX labelling buffers |
| Deuterium oxide (99.9% D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-4 | Deuterated water |
| DynamX 3.0 | Waters Corporation | 176016027 | Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation |
| Enzymate BEH Pepsin Column | Waters Corporation | 186007233 | Pepsin digestion column |
| Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade | Fisher Scientific | 10596814 | For LC mobile phases |
| Guanidinium hydrochloride | Sigma Aldrich | RDD001-500G | Chaotrope/Denaturant |
| HDfleX | University of Exeter | N/A | https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982 |
| KCl | Sigma Aldrich | P3911 | Salt for HDX buffers |
| LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot | Waters Corporation | 725000637 | Autosampler robot |
| Leucine enkephalin | Waters Corporation | 186006013 | For mass spectrometry lockspray calibration. |
| MassLynx | Waters Corporation | 667004007 | Software controlling inlet methods and mass spectrometer |
| Maximum recovery vials | Waters Corporation | 600000670CV | 100 pack including caps – used for quench tray in LEAP HDX-2 |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Salt for HDX buffers |
| Millipore 0.22 µm syringe filters | Millipore | N9CA7069B | Syringe filters |
| ms2min | Applied Photophysics Ltd | N/A | fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | Salt for HDX buffers |
| Peltier temperature controller | LEAP Technologies Inc. | HP115-COOL/D | Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot. |
| ProteinLynx Global Server 3.0 | Waters Corporation | 715001030 | Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors. |
| Reagent pot caps | Waters Corporation | 186004632 | 100 pack |
| Reagent pots for LEAP HDX-2 | Waters Corporation | 186001420 | 100 pack excluding caps – used for buffers in LEAP HDX-2 |
| Sodium deuteroxide (99.5% in D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-57 | For HDX labelling buffers |
| Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO) | Amicon (Merck Sigma Aldrich) | UFC5003 | Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments. |
| Synapt G2-Si mass spectrometer | Waters Corporation | 176850035 | Mass spectrometer |
| Total recovery vials | Waters Corporation | 600000671CV | 100 pack including caps – used for labelling tray in LEAP HDX-2 |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253-250G | Buffer |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T60040-B2005 | Buffer |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378-1KG | Chaotrope/Denaturant |
| VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column | Waters Corporation | 186004623 | Trap desalting column |
References
- Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson’s disease, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
- Breydo, L., Wu, J. W., Uversky, V. N. α-Synuclein misfolding and Parkinson’s disease. Biochimica et Biophysica Acta (BBA): Molecular Basis of Disease. 1822 (2), 261-285 (2012).
- Dedmon, M. M., Lindorff-Larsen, K., Christodoulou, J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. Mapping long-range interactions in α-synuclein using spin-label NMR and ensemble molecular dynamics simulations. Journal of the American Chemical Society. 127 (2), 476-477 (2005).
- Esteban-Martín, S., Silvestre-Ryan, J., Bertoncini, C. W., Salvatella, X. Identification of fibril-like tertiary contacts in soluble monomeric α-synuclein. Biophysical Journal. 105 (5), 1192-1198 (2013).
- McClendon, S., Rospigliosi, C. C., Eliezer, D. Charge neutralization and collapse of the C-terminal tail of alpha-synuclein at low pH. Protein Science. 18 (7), 1531-1540 (2009).
- Ranjan, P., Kumar, A. Perturbation in long-range contacts modulates the kinetics of amyloid formation in α-synuclein familial mutants. ACS Chemical Neuroscience. 8 (10), 2235-2246 (2017).
- Villar-Piqué, A., da Fonseca, T. L., Outeiro, T. F. Structure, function and toxicity of alpha-synuclein: the Bermuda triangle in synucleinopathies. Journal of Neurochemistry. 139, 240-255 (2015).
- Seetaloo, N., Zacharopoulou, M., Stephens, A. D., Schierle, G. S. K., Phillips, J. J. Local structural dynamics of alpha-synuclein correlate with aggregation in different physiological conditions. bioRxiv. , (2022).
- Stephens, A. D., et al. Extent of N-terminus exposure of monomeric alpha-synuclein determines its aggregation propensity. Nature Communications. 11 (1), 2820 (2020).
- Stephens, A. D., et al. Different structural conformers of monomeric α-synuclein identified after lyophilizing and freezing. Analytical Chemistry. 90 (11), 6975-6983 (2018).
- Lautenschläger, J., et al. C-terminal calcium binding of α-synuclein modulates synaptic vesicle interaction. Nature Communications. 9 (1), 712 (2018).
- Oganesyan, I., Lento, C., Tandon, A., Wilson, D. J. Conformational dynamics of α-synuclein during the interaction with phospholipid nanodiscs by millisecond hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (5), 1169-1179 (2021).
- Keppel, T. R., Weis, D. D. Analysis of disordered proteins using a simple apparatus for millisecond quench-flow H/D exchange. Analytical Chemistry. 85 (10), 5161-5168 (2013).
- Al-Naqshabandi, M. A., Weis, D. D. Quantifying protection in disordered proteins using millisecond hydrogen exchange-mass spectrometry and peptic reference peptides. 生物化学. 56 (31), 4064-4072 (2017).
- Kish, M., et al. Allosteric regulation of glycogen phosphorylase solution phase structural dynamics at high spatial resolution. bioRxiv. , (2019).
- El-Amine, M., et al. Mechanisms of tolerance induction by a gene-transferred peptide-IgG fusion protein expressed in B lineage cells. Journal of Immunology. 165 (10), 5631-5636 (2000).
- Kishimoto, S., et al. Site-specific chemical conjugation of antibodies by using affinity peptide for the development of therapeutic antibody format. Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 698-702 (2019).
- Xu, W., et al. A protein-based, long-acting HIV-1 fusion inhibitor with an improved pharmacokinetic profile. Pharmaceuticals. 15 (4), 424 (2022).
- Frías, J. P., et al. Tirzepatide versus semaglutide once weekly in patients with type 2 diabetes. The New England Journal of Medicine. 385 (6), 503-515 (2021).
- Gerstein, H. C., et al. Cardiovascular and renal outcomes with efpeglenatide in type 2 diabetes. The New England Journal of Medicine. 385 (10), 896-907 (2021).
- Largy, E., Gabelica, V. Native hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry of structured DNA oligonucleotides. Analytical Chemistry. 92 (6), 4402-4410 (2020).
- Marcsisin, S. R., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry: What is it and what can it tell us. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (3), 967-972 (2010).
- Glasoe, P. K., Long, F. A. Use of glass electrodes to measure acidities in deuterium oxide. Journal of Physical Chemistry. 64 (1), 188-190 (1960).
- Krȩzel, A., Bal, W. A formula for correlating pKa values determined in D2O and H2O. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (1), 161-166 (2004).
- Mayerhöfer, T. G., Pahlow, S., Popp, J. The Bouguer-Beer-Lambert law: Shining light on the obscure. ChemPhysChem. 21 (18), 2029-2046 (2020).
- Gasteiger, E., et al. . The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).
- Bateman, R. H., et al. A novel precursor ion discovery method on a hybrid quadrupole orthogonal acceleration time-of-flight (Q-TOF) mass spectrometer for studying protein phosphorylation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 13 (7), 792-803 (2002).
- Sørensen, L., Salbo, R. Optimized workflow for selecting peptides for HDX-MS data analyses. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (11), 2278-2281 (2018).
- Demmers, J. A. A., Rijkers, D. T. S., Haverkamp, J., Killian, J. A., Heck, A. J. R. Factors affecting gas-phase deuterium scrambling in peptide ions and their implications for protein structure determination. Journal of the American Chemical Society. 124 (37), 11191-11198 (2002).
- Seetaloo, N., Kish, M., Phillips, J. J. HDfleX: Software for flexible high structural resolution of hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry data. Analytical Chemistry. 94 (11), 4557-4564 (2022).
- Hageman, T. S., Weis, D. D. Reliable identification of significant differences in differential hydrogen exchange-mass spectrometry measurements using a hybrid significance testing approach. Analytical Chemistry. 91 (13), 8008-8016 (2019).
- Hageman, T. S., Weis, D. D. A structural variant approach for establishing a detection limit in differential hydrogen exchange-mass spectrometry measurements. Analytical Chemistry. 91 (13), 8017-8024 (2019).
- Chetty, P. S., et al. Helical structure and stability in human apolipoprotein A-I by hydrogen exchange and mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19005-19010 (2009).
- Keppel, T. R., Weis, D. D. Mapping residual structure in intrinsically disordered proteins at residue resolution using millisecond hydrogen/deuterium exchange and residue averaging. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 547-554 (2015).
- Li, J., Rodnin, M. V., Ladokhin, A. S., Gross, M. L. Hydrogen-deuterium exchange and mass spectrometry reveal the pH-dependent conformational changes of diphtheria toxin T domain. 生物化学. 53 (43), 6849-6856 (2014).
- Roder, H., Elöve, G. A., Englander, S. W. Structural characterization of folding intermediates in cytochrome c by H-exchange labelling and proton NMR. Nature. 335 (6192), 700-704 (1988).
- Rob, T., et al. Measuring dynamics in weakly structured regions of proteins using microfluidics-enabled subsecond H/D exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (8), 3771-3779 (2012).
- Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13 (13), 2528-2532 (2013).
- Svejdal, R. R., Dickinson, E. R., Sticker, D., Kutter, J. P., Rand, K. D. Thiol-ene microfluidic chip for performing hydrogen/deuterium exchange of proteins at subsecond time scales. Analytical Chemistry. 91 (2), 1309-1317 (2018).
- Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
- Coales, S. J., E, S. Y., Lee, J. E., Ma, A., Morrow, J. A., Hamuro, Y. Expansion of time window for mass spectrometric measurement of amide hydrogen/deuterium exchange reactions. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (24), 3585-3592 (2010).
- Hoyer, W., et al. Dependence of alpha-synuclein aggregate morphology on solution conditions. Journal of Molecular Biology. 322 (2), 383-393 (2002).
- Rand, K. D., Pringle, S. D., Morris, M., Engen, J. R., Brown, J. M. ETD in a traveling wave ion guide at tuned Z-spray ion source conditions allows for site-specific hydrogen/deuterium exchange measurements. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22 (10), 1784-1793 (2011).
- Kan, Z. Y., Ye, X., Skinner, J. J., Mayne, L., Englander, S. W. ExMS2: An integrated solution for hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry data analysis. Analytical Chemistry. 91 (11), 7474-7481 (2019).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Characterizing short-lived protein folding intermediates by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (20), 8591-8597 (2010).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
- Mistarz, U. H., et al. Photodissociation mass spectrometry accurately localizes sites of backbone deuteration in peptides. Analytical Chemistry. 90 (2), 1077-1080 (2017).
- Phillips, J. J., et al. Rate of asparagine deamidation in a monoclonal antibody correlating with hydrogen exchange rate at adjacent downstream residues. Analytical Chemistry. 89 (4), 2361-2368 (2017).
