Ensayo CAM-Delam para puntuar las propiedades metastásicas mediante la cuantificación de la delaminación y la capacidad de invasión de las células cancerosas

En resumen, la Figura 1 resume los pasos generales en el ensayo CAM-Delam. El siguiente protocolo se basa en 30 huevos de gallina fertilizados cultivados y el uso de dos líneas celulares de cáncer diferentes sembradas por separado en tres anillos / huevo y analizadas en cuatro puntos de tiempo. 1. Incubación de huevos Use huevos de pollitos fertilizados de un criadero local, que garanticen más del 90% de fertilizaciónNOTA: Los huevos no deben haberse almacenado durante más de 4 días a temperatura ambiente (RT). En Suecia, el permiso ético para el uso experimental de pollos embrionarios solo se requiere a partir del día embrionario (E) 14 y más allá. Si es necesario, limpie mecánicamente cuidadosamente cualquier suciedad o plumas en los huevos con una toalla de papel seca o mojada en agua. Limpie y esterilice la incubadora de huevos con etanol al 70% antes de su uso (cada vez). Coloque el número deseado de huevos en bandejas de huevos e incube los huevos de los pollitos horizontalmente en una incubadora de huevos a 37.5-38 ° C con un 70% de humedad. Considere esto como el día de incubación 0 (Figura 1A). 2. Preparación de botes de pesaje, cajas de plástico e instrumentos de disección Use etanol al 70% para esterilizar 30 botes de pesaje y 30 pequeñas cajas de plástico (~ 0.4 L) con tapas transparentes. Seque los botes de pesaje y las cajas en una campana laminar durante la noche (ON) y guárdelos en una caja de plástico cerrada hasta su uso posterior el día 3 de la incubación. Esterilizar 2 L de H2O destilado o desionizado por cada 30 huevos incubados. Esterilizar dos pares de tijeras y tres pares de fórceps rociando etanol al 70%. Seque al aire los instrumentos y luego guárdelos en una caja esterilizada hasta el día 3 de incubación.NOTA: Estas acciones (Pasos 2.1-2.4) se pueden realizar cualquier día antes del día 3 de incubación. Use guantes para evitar la contaminación. 3. Apertura de los huevos y transferencia a la cámara humidificada interna NOTA: Use guantes y una máscara facial para evitar la contaminación. Agregue aproximadamente 50 ml de H2O esterilizado a las cajas de plástico esterilizadas. Mantenga las cajas llenas de agua con tapas cerradas, para evitar la contaminación, en RT hasta su uso. En el día 3 de incubación, rompa la cáscara del huevo con la parte afilada de las tijeras y corte una abertura recta en la cáscara. Abra manualmente la cáscara del huevo sobre un bote de pesaje y recoja la clara de huevo, la yema y su embrión sano adjunto en el bote de pesaje (Figura 1B). Busque un embrión intacto con un corazón latiendo, yema intacta y vasos sanguíneos desarrollados para el experimento (>95% de los huevos incubados). Descarte los óvulos con un embrión malformado, un embrión sin un corazón latiendo, una yema de huevo rota o vasos sanguíneos de yema dañados. Transfiera suavemente el bote de pesaje a una cámara humidificada interna.NOTA: Para los pasos 3.2.-3.4., trabaje lo más rápido posible para evitar la contaminación y, si es posible, use una campana laminar. Incubar la cámara humidificada interna en la incubadora de huevos (Figura 1C). Cultive los huevos sin cáscara desde el día 3 hasta el día 10 en la incubadora de huevos antes de ser utilizados (consulte el Paso 3.6.), y cuando sea necesario, agregue agua a la incubadora para mantener un 70% de humedad. Revise las cámaras humidificadas internas a través de la tapa de plástico transparente en busca de embriones muertos o huevos contaminados sin cáscara todos los días, y retírelos de la incubadora. 4. Preparación de anillos de silicona Para preparar anillos de silicona, corte un tubo de silicona con un diámetro interno y externo de 4 mm y 5 mm, respectivamente, en ~ 1 mm de grosor, preferiblemente usando un cortador de papel (Figura 1D). Transfiera los anillos de silicona a pequeñas botellas de vidrio (Figura 1D), cúbralos con lámina de metal y esterilícelos con un autoclave o similar.NOTA: Evite el autoclave repetido de anillos de silicona no utilizados que puedan estar contaminados, ya que dicho tratamiento disminuye la capacidad de los anillos de silicona para adherirse a la membrana, con la posterior fuga de la solución de célula cancerosa / colágeno / RPMI fuera de los anillos. Guarde los anillos de silicona estériles en RT.NOTA: Este paso se puede realizar cualquier día antes del día 10 de incubación. 5. Preparación de células cancerosas NOTA: Las soluciones como el medio de cultivo celular, la tripsina y 1x PBS se almacenan a 4 °C y deben calentarse a 37 °C en un baño de agua antes de agregarse a las células. Después del calentamiento, enjuague las botellas en etanol al 70% y séquelas antes de usarlas. Cultivar las líneas celulares cancerosas de interés en el medio de cultivo correspondiente en una incubadora de cultivo celular a 37 °C en presencia de 5% (v/v) de CO2.NOTA: Aquí, el glioblastoma U251-GFP y las células de cáncer de próstata PC-3U-GFP se cultivaron en medio RPMI medio RPMI completo suplementado con 10% (v / v) suero fetal bovino (FBS) y 1% (v / v) penicilina-estreptomicina (PS). Planifique el cultivo de células cancerosas para que aproximadamente 50 × 106 células cancerosas estén listas para la recolección en el día de incubación 10 del ensayo CAM-Delam. Cambie el medio de cultivo celular cada 2-3 días, o cuando el color del medio cambie de rosa a naranja / amarillo. Opcional: Inducir hipoxia mediante el tratamiento de las células cancerosas con CoCl2 para investigar los efectos mecanicistas moleculares sobre la delaminación 1 día antes de la recolección celular.PRECAUCIÓN: CoCl2 tiene toxicidad moderada. Manipule con cuidado en una campana extractora de humos y siga las instrucciones del fabricante. Preparar una solución madre fresca de CoCl2 de 20 mM disolviendo 0,0258 g en 10 ml de H20 destilado esterilizado en un tubo cónico de 15 ml envuelto con papel de aluminio para proteger de la luz. En un tubo cónico de 50 ml, mezcle 250 μL de la solución madre de CoCl2 de 20 mM en 25 ml de medio RPMI suplementado con 1% (v/v) PS (pero sin FBS) por plato de cultivo celular de 15 cm de diámetro. Vórtice suavemente. Retire el medio RPMI completo de las placas de cultivo celular. Lave las células con 1x PBS 2x esterilizado. Añadir 25 ml de medio RPMI con tripsinización de células CoCl2 de 200 μM (consulte el paso 5.6). En el día 10 de incubación de huevos, preparar 1 ml de una mezcla de colágeno/RPMI (relación 1:3), que contenga 250 μL de colágeno tipo I (5 mg/ml) y 750 μL de medio RPMI de cultivo celular suplementado con 10% de FBS y 1% (v/v) de PS. Mantenga la mezcla de colágeno/RPMI en hielo. Tripsinizar las células cancerosas para aislar las células eliminando primero el medio de cultivo celular y lavar 2x con 1x PBS. Añadir 3 ml de solución de tripsina (0,05%) por plato de cultivo celular de 15 cm de diámetro e incubar durante 2-3 min en una incubadora de cultivo celular hasta que las células se desprendan. Use un microscopio invertido de mesa para ver las células desprendidas. Si es necesario, golpee suavemente el costado del matraz para desalojar las células agrupadas o unidas restantes. Inactive la tripsina agregando 5 ml de medio RPMI completo a cada plato de cultivo celular y recoja la suspensión celular de todos los platos de cultivo celular en un tubo de 50 ml. Cuente las células cancerosas mediante el método de exclusión Trypan Blue para distinguir las células vivas de las muertas utilizando un contador celular. Añadir 10 μL de la suspensión celular a 10 μL de tinción azul tripano al 0,4%. Mezcle la muestra mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo varias veces, y luego cargue 10 μL de la mezcla de celdas por cámara en el portaobjetos de muestra en el contador de celdas. Repita el conteo de celdas 3x para verificar el número de celda/ml. Calcule y centrifugue la suspensión de cultivo celular de volumen correcto que contenga 50 x 106 células cancerosas vivas en un tubo de 50 ml a 500 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y mezcle el pellet celular con 1 ml de la mezcla de colágeno / RPMI. Como el colágeno es un material gelatinoso, mezcle las células muy lenta y cuidadosamente con una pipeta de 1 ml para evitar la pérdida de células en la formación de burbujas. Mantenga la suspensión celular preparada en hielo y llévela al área de trabajo de huevos.NOTA: Evite mantener las células cancerosas preparadas en hielo durante demasiado tiempo. Las células cancerosas preparadas deben colocarse en el CAM dentro de los 15-25 minutos. 6. Siembra de las células cancerosas en el CAM NOTA: Use guantes y una máscara facial para evitar la contaminación. En el día 10 de incubación, saque las cámaras humidificadas internas con los huevos incubados sin cáscara de la incubadora.NOTA: Se puede utilizar aproximadamente el 90% del número inicial de los huevos incubados; ver Figura 2. Abra la cámara humidificada interna y coloque hasta seis anillos de silicona en el CAM con fórceps esterilizados.NOTA: Evite colocar los anillos de silicona cerca uno del otro o cerca de vasos sanguíneos más grandes. Mezcle la suspensión de células cancerosas mediante pipeteo para obtener una distribución uniforme de las células cancerosas y agregue 20 μL (1 × 106 células) de la suspensión de células cancerosas preparada dentro de un anillo de silicona (Figura 1E). Al agregar las células, mantenga la punta de la pipeta por encima del CAM para asegurarse de no dañar la membrana.NOTA: De acuerdo con los hallazgos anteriores7, se pueden sembrar diferentes células cancerosas en anillos separados en el mismo CAM. Cierre la cámara humidificada interna y colóquela en la incubadora de huevos. 7. Aislamiento del CAM con células cancerosas asociadas Después de 14 h, 1.5 días, 2.5 días y 3.5 días de incubación, saque aproximadamente siete cámaras humidificadas internas y abra las tapas una a la vez. Con un par de tijeras, diseccionar las células cancerosas cultivadas unidas a la CAM (las llamadas muestras CAM-Delam) cortando fuera del anillo de silicona (Figura 1F). Transfiera inmediatamente la muestra aislada de CAM-Delam utilizando fórceps al 4% de paraformaldehído (PFA) en un tampón de fosfato (PB) de 0,1 M en una placa de Petri para la fijación del tejido. Mantener en hielo o a 4 °C durante 1 h.NOTA: Conservar la solución de PFA al 4% a 4 °C durante un máximo de 5 días. PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico. Cuando manipule polvo de PFA y soluciones de PFA, use una campana de humos y use una máscara facial y guantes. Evite inhalar vapores de polvo o solución. Siga las instrucciones del fabricante. Decapitar los embriones de pollo y desecharlos como residuos biológicos en contenedores específicos. Retire la solución de PFA al 4% y agregue sacarosa al 30% en 0,1 M pb a las muestras de CAM-Delam y equilibre a 4 °C durante 1 h. Bajo un microscopio de disección, retire cuidadosamente el anillo de silicona con fórceps. Con un par de tijeras, corte la muestra de CAM-Delam en forma rectangular con las células cancerosas en el medio (Figura 1G). Con un par de fórceps, transfiera las muestras de CAM-Delam al medio de sección congelado en una placa de Petri para eliminar el exceso de sacarosa y luego a incrustar moldes en el medio de sección congelado. Bajo un microscopio de disección, coloque la muestra CAM-Delam en forma de U en dirección vertical en los moldes de incrustación utilizando cualquier instrumento similar a una aguja (Figura 1G). Congele y almacene las muestras de CAM-Delam a -80 °C. 8. Seccionamiento de muestras CAM-Delam Seccione las muestras CONGELADAS de CAM-Delam a 10 μm en 5-6 diapositivas consecutivas mediante crioseccionación. Guarde los portaobjetos con secciones a -80 °C o úselos directamente para la tinción inmunohistoquímica. 9. Tinción inmunohistoquímica Lleve los portaobjetos de -80 °C a RT durante 5 minutos antes de iniciar el inmunoprotocolo. Haga una línea con un marcador hidrofóbico en las diapositivas donde terminan las secciones. Déjalos secar durante unos minutos. Coloque los portaobjetos en una cámara humidificada (H2O) y cubra las secciones con ~ 200-500 μL de solución bloqueadora (suero fetal de ternero al 10% y azida de sodio al 0.1% en solución salina tamponada tris con Triton X-100 al 0.1% [TBST]) e incube durante 15-30 min.NOTA: A partir de este paso, no deje que las diapositivas se sequen en ningún momento. Vierta la solución de bloqueo y reemplácela con 100-150 μL del anticuerpo primario de interés diluido en la solución de bloqueo e incube ON a 4 ° C. Preferiblemente use anticuerpos anti-laminina-111 de conejo para definir la lámina basal junto con un marcador de células cancerosas, si no usa GFP u otras líneas celulares de cáncer marcadas con fluorescencia.NOTA: Aquí, también se utilizó un factor anti-von Willebrand de conejo para detectar vasos sanguíneos en el CAM. Prepare tres cubetas de vidrio llenas de tampón TBST. Vierta la solución primaria de anticuerpos, transfiera los portaobjetos a las cubetas de vidrio y lave al menos 3 veces durante 5 minutos cada una en TBST. Retire el exceso de TBST del portaobjetos y del área de barrera hidrofóbica con un pañuelo de papel blando. Cubra el portaobjetos con 100-150 μL de un anticuerpo fluorescente secundario adecuado diluido en solución bloqueadora combinada con 4′,6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato (DAPI) e incube en la oscuridad a RT durante 1 h. Vierta la solución secundaria de anticuerpos, transfiera los portaobjetos a las cubetas de vidrio y lave al menos 3 veces durante 5 minutos cada una en TBST. Retire el exceso de TBST del portaobjetos y del área de barrera hidrofóbica con un pañuelo de papel blando. Monte las diapositivas colocando 1-2 gotas de medio de montaje fluorescente en la diapositiva y coloque suavemente una cubierta de vidrio, evitando burbujas de aire. Deje que los portaobjetos se sequen durante al menos 1 h a 4 °C antes de analizarlos, y guarde los portaobjetos a 4 °C. 10. Puntuación de imágenes de microscopía y delaminación Fotografíe las secciones utilizando un microscopio de epifluorescencia equipado con una cámara digital, preferiblemente con un aumento de 10x (Figura 1H). Analice las secciones utilizando las siguientes categorías de puntuación CAM-Delam (Figura 3): Busque lámina basal intacta sin alteraciones visibles. Busque lámina basal alterada pero no dañada. Busque lámina basal dañada sin invasión celular. Busque lámina basal dañada con invasión celular.