CAM-Delam Assay, 암세포의 박리 및 침윤 능력을 정량화하여 전이성 특성을 점수화하기 위한 분석

간단히 말해서, 도 1은 CAM-Delam 분석에서의 전체 단계를 요약한 것이다. 아래 프로토콜은 30 개의 배양 된 수정 된 닭고기 달걀과 세 개의 고리 / 난자에 별도로 시딩되고 네 가지 시점에서 분석 된 두 개의 다른 암 세포주의 사용을 기반으로합니다. 1. 계란 부화 90 % 이상의 수정을 보장하는 지역 부화장에서 수정 된 병아리 알을 사용하십시오.참고 : 계란은 실온 (RT)에서 4 일 이상 보관해서는 안됩니다. 스웨덴에서는 배아 닭의 실험적 사용에 대한 윤리적 허가가 배아 일 (E) 14 이상에서만 필요합니다. 필요한 경우 마른 종이 타월을 사용하거나 물에 적신 계란의 먼지 나 깃털을 조심스럽게 기계적으로 닦아냅니다. 계란 인큐베이터를 사용하기 전에 (매번) 70 % 에탄올로 청소하고 멸균하십시오. 원하는 수의 알을 달걀 쟁반에 넣고 병아리 알을 70 % 습도의 37.5-38 °C의 달걀 인큐베이터에서 수평으로 배양하십시오. 이것을 잠복기 0일로 간주하십시오 (그림 1A). 2. 계량 보트, 플라스틱 상자 및 해부 장비 준비 70 % 에탄올을 사용하여 투명 캡으로 30 개의 계량 보트와 30 개의 작은 플라스틱 상자 (~ 0.4 L)를 살균하십시오. 계량 보트와 상자를 하룻밤 사이에 층상 후드(ON)에서 건조시키고 인큐베이션 3일에 추가로 사용할 때까지 닫힌 플라스틱 상자에 보관하십시오. 배양된 계란 30개당 2L의 증류 또는 탈이온화된H2O를 멸균한다. 70 % 에탄올을 분무하여 두 쌍의 가위와 세 쌍의 포셉을 살균하십시오. 기구를 공기 건조시킨 다음 잠복기 3 일까지 멸균 된 상자에 보관하십시오.참고: 이러한 작업(단계 2.1-2.4)은 잠복기 3일 전날 언제든지 수행할 수 있습니다. 오염을 피하기 위해 장갑을 사용하십시오. 3. 계란을 열고 내부 가습실로 옮깁니다. 참고: 오염을 방지하기 위해 장갑과 얼굴 마스크를 사용하십시오. 약 50 mL의 멸균된H2O를 멸균된 플라스틱 박스에 첨가한다. 오염을 피하기 위해 물이 채워진 상자는 뚜껑을 닫은 채로 사용할 때까지 RT에 보관하십시오. 잠복기 3 일째에 가위의 날카로운 부분을 사용하여 달걀 껍질을 부수고 껍질에서 곧은 개구부를 자릅니다. 수동으로 계량 보트 위에 달걀 껍질을 열고 계량 보트에서 달걀 흰자위, 노른자 및 부착 된 건강한 배아를 수집합니다 (그림 1B). 심장이 뛰고, 노른자가 손상되지 않았으며, 실험을 위해 혈관이 발달 된 손상되지 않은 배아를 찾으십시오 (배양 된 난자의 >95 %). 기형 배아, 심장이 뛰지 않는 배아, 부러진 난황 또는 손상된 노른자 혈관이있는 난자를 버리십시오. 계량 보트를 내부 가습실로 부드럽게 옮깁니다.참고: 단계 3.2.-3.4.의 경우 오염을 피하기 위해 가능한 한 빨리 작업하고 가능한 경우 층류 후드를 사용하십시오. 계란 인큐베이터에서 내부 가습 챔버를 인큐베이션한다(그림 1C). 껍질이 없는 난자를 사용하기 전에 계란 배양기에서 3일째부터 10일째까지 배양하고(단계 3.6 참조), 필요할 때 배양기에 물을 첨가하여 70% 습도를 유지한다. 투명한 플라스틱 뚜껑을 통해 내부 가습 챔버에서 매일 죽은 배아 또는 오염 된 껍질이없는 난자가 있는지 확인하고 인큐베이터에서 제거하십시오. 4. 실리콘 고리의 제조 실리콘 링을 제조하려면 내경과 외경이 각각 4mm 및 5mm인 실리콘 튜브를 ∼1mm 두께로, 바람직하게는 종이 커터를 사용하여 절단한다(그림 1D). 실리콘 링을 작은 유리 병으로 옮기고(그림 1D), 금속 호일로 덮은 다음 오토클레이브 등을 사용하여 멸균합니다.참고: 오염될 수 있는 사용하지 않는 실리콘 링의 반복적인 오토클레이빙은 피하십시오, 왜냐하면 그러한 처리는 실리콘 링이 멤브레인에 부착되는 용량을 감소시키고, 이후에 암 세포/콜라겐/RPMI 용액이 링 외부로 누출되기 때문입니다. 멸균 실리콘 링을 RT에 보관하십시오.참고: 이 단계는 잠복기 10일 하루 전에 언제든지 수행할 수 있습니다. 5. 암세포의 제조 참고: 세포 배양 배지, 트립신 및 1x PBS와 같은 용액은 4°C에서 저장되며 세포에 첨가하기 전에 수조에서 37°C로 가열해야 합니다. 가열 후 병을 70 % 에탄올로 헹구고 사용하기 전에 말리십시오. 관련 배지에 관심있는 암 세포주를 5% (v/v)CO2의 존재 하에 37°C의 세포 배양 배양기에서 배양한다.참고: 여기에서, U251-GFP 교모세포종 및 PC-3U-GFP 전립선암 세포를 10%(v/v) 태아 소 혈청(FBS) 및 1%(v/v) 페니실린-스트렙토마이신(PS)이 보충된 완전한 RPMI 배지-RPMI 배지에서 배양하였다. 약 50 × 10,6 개의 암세포가 CAM-Delam 분석의 배양 10일에 수확 준비가 되도록 암세포의 배양을 계획한다. 세포 배양 배지를 2-3 일마다 또는 배지 색상이 분홍색에서 주황색 / 노란색으로 바뀔 때 변경하십시오. 선택사항: 암세포를CoCl2 로 처리하여 저산소증을 유발하여 세포 수확 1일 전에 박리에 대한 분자 기계론적 효과를 조사한다.주의:CoCl2 는 적당한 독성을 가지고 있습니다. 흄 후드에서주의 깊게 취급하고 제조업체의 지침을 따르십시오. 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 싸인 15 mL 원뿔형 튜브에 멸균 증류H200 10 mL에 0.0258 g을 용해시켜 신선한 20 mM CoCl2원액을 준비한다. 50 mL 원뿔형 튜브에서, 직경 15 cm 당 1% (v/v) PS (FBS는 제외)로 보충된 RPMI 배지 25 mL에 20 mM CoCl2원액 250 μL를 섞는다. 부드럽게 소용돌이. 세포 배양 접시에서 완전한 RPMI 배지를 제거한다. 세포를 멸균된 1x PBS 2x로 세척한다. 200 μM CoCl2 세포 트립신화로 RPMI 배지25 mL를 첨가한다(단계 5.6 참조). 계란 배양 10일째에, 250 μL의 타입 I 콜라겐(5 mg/mL)과 10% FBS와 1%(v/v) PS로 보충된 750 μL의 세포 배양 RPMI 배지를 포함하는 콜라겐/RPMI 믹스 1 mL를 준비한다. 암세포를 트립신화하여 세포를 분리하여 먼저 세포 배양액을 제거하고 1x PBS로 2x 세척한다. 직경 15 cm 세포 배양 접시 당 트립신 용액 3 mL (0.05%)를 첨가하고, 세포가 분리될 때까지 세포 배양 배양기에서 2-3분 동안 인큐베이션한다. 테이블 상단의 거꾸로 된 현미경을 사용하여 분리 된 세포를 확인하십시오. 필요한 경우 플라스크의 측면을 부드럽게 탭하여 남아있는 클러스터 또는 부착 된 세포를 제거하십시오. 5 mL의 완전한 RPMI 배지를 각 세포 배양 접시에 첨가하여 트립신을 불활성화시키고 모든 세포 배양 접시에서 세포 현탁액을 50 mL 튜브로 수집한다. Trypan Blue 배제 방법에 의해 암세포를 계수하여 세포 카운터를 사용하여 죽은 세포와 살아있는 세포를 구별한다. 10 μL의 세포 현탁액을 0.4% 트리판 블루 염색의 10 μL에 첨가한다. 샘플을 몇 번 위아래로 피펫팅하여 혼합한 다음, 챔버 당 10 μL의 세포 혼합물을 세포 카운터의 샘플 슬라이드에 로딩한다. 셀 카운팅 3x를 반복하여 셀 번호/mL를 확인합니다. 계산하고 500 × g에서 50 mL 튜브에서 50 x 106 살아있는 암 세포를 함유하는 정확한 부피 세포 배양 현탁액을 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 콜라겐/RPMI 믹스 1mL와 섞는다. 콜라겐은 젤라틴 물질이므로 거품 형성시 세포가 손실되지 않도록 1mL 피펫으로 세포를 매우 천천히 조심스럽게 혼합하십시오. 준비된 세포 현탁액을 얼음 위에 보관하고 계란 작업 영역으로 가져 오십시오.참고 : 준비된 암세포를 얼음 위에 너무 오래 보관하지 마십시오. 준비된 암세포는 15-25 분 이내에 CAM에 놓아야합니다. 6. CAM에 암세포 시딩 참고: 오염을 방지하기 위해 장갑과 얼굴 마스크를 사용하십시오. 인큐베이션 10 일째에, 인큐베이터에서 인큐베이터 껍질이없는 알과 함께 내부 가습 챔버를 꺼내십시오.참고 : 배양 된 계란의 초기 수의 약 90 %가 사용될 수 있습니다. 그림 2를 참조하십시오. 내부 가습 챔버를 열고 멸균 된 포셉을 사용하여 CAM에 최대 여섯 개의 실리콘 링을 놓습니다.참고: 실리콘 링을 서로 가까이 두거나 더 큰 혈관에 가깝게 두지 마십시오. 피펫팅에 의해 암 세포 현탁액을 혼합하여 암 세포의 균일한 분포를 얻고, 제조된 암 세포 현탁액 20 μL(1 × 10,6 세포)를 실리콘 링 내부에 첨가한다(도 1E). 세포를 추가 할 때 피펫 팁을 CAM 위에 두어 멤브레인이 손상되지 않도록하십시오.참고 : 이전 연구 결과7에 따르면 다른 암세포는 동일한 CAM의 별도의 고리에 시드 될 수 있습니다. 내부 가습 챔버를 닫고 계란 인큐베이터에 넣으십시오. 7. 연관된 암 세포와 CAM의 분리 14 시간, 1.5 일, 2.5 일 및 3.5 일의 배양 후 약 7 개의 내부 가습 챔버를 꺼내 한 번에 하나씩 뚜껑을 엽니 다. 한 쌍의 가위로 실리콘 링 외부를 절단하여 CAM에 부착된 배양된 암세포(소위 CAM-Delam 샘플)를 해부한다(그림 1F). 포셉을 사용하여 단리된 CAM-Delam 샘플을 즉시 조직의 고정을 위해 페트리 디쉬의 0.1 M 인산염 완충액 (PB) 중의 4% 파라포름알데히드 (PFA)로 옮긴다. 얼음 위에 또는 4 °C에서 1 시간 동안 유지하십시오.참고: 4% PFA 용액을 4°C에서 최대 5일 동안 보관하십시오. 주의: PFA는 독성이 있습니다. PFA 파우더 및 PFA 용액을 취급 할 때는 흄 후드를 사용하고 얼굴 마스크와 장갑을 착용하십시오. 분말 또는 용액 증기를 흡입하지 마십시오. 제조업체의 지침을 따릅니다. 닭 배아를 무력화시키고 특정 쓰레기통에 생물학적 폐기물로 버리십시오. 4% PFA 용액을 제거하고 0.1 M PB 중의 30% 수크로오스를 CAM-Delam 샘플에 첨가하고, 4°C에서 1시간 동안 평형화시킨다. 해부 현미경으로 포셉을 사용하여 실리콘 링을 조심스럽게 제거하십시오. 한 쌍의 가위로 CAM-Delam 샘플을 중간에 암세포가 있는 직사각형 모양으로 자릅니다(그림 1G). 한 쌍의 포셉으로 CAM-Delam 샘플을 페트리 접시의 냉동 섹션 배지로 옮겨 과도한 자당을 제거한 다음 몰드를 냉동 섹션 배지에 임베딩합니다. 해부 현미경 하에서 CAM-Delam 샘플을 바늘 모양의 기기를 사용하여 임베딩 몰드에 수직 방향으로 U 자형으로 배치합니다(그림 1G). CAM-Delam 샘플을 동결시키고 -80°C에서 보관한다. 8. CAM-Delam 샘플 단면화 냉동된 CAM-Delam 샘플을 냉동 절법을 사용하여 5-6회 연속 슬라이드 상에서 10 μm로 절편한다. 절편이 있는 슬라이드를 -80°C에 보관하거나 면역조직화학 염색에 직접 사용하십시오. 9. 면역조직화학 염색 면역 프로토콜을 시작하기 전에 슬라이드를 -80 °C에서 RT로 5 분 동안 가져 오십시오. 섹션이 끝나는 슬라이드에 소수성 마커가있는 선을 만듭니다. 몇 분 동안 말리십시오. 슬라이드를 가습된(H2O) 챔버에 놓고, 절편을 ∼200-500 μL의 블로킹 용액(0.1% 트리톤 X-100[TBST]로 트리스 완충 식염수 중 10% 태아 송아지 혈청 및 0.1% 소듐 아지드)으로 덮고 15-30분 동안 인큐베이션한다.참고: 이 단계부터 슬라이드가 건조되지 않도록 하십시오. 블로킹 용액을 붓고 블로킹 용액에 희석된 목적하는 일차 항체 100-150 μL로 교체하고 4°C에서 ON으로 인큐베이션한다. 바람직하게는 GFP 또는 다른 형광 태깅된 암 세포주를 사용하지 않을 경우 암 세포 마커와 함께 기저 라미나를 정의하기 위해 토끼 항-라미닌-111 항체를 사용한다.참고 : 여기에서 토끼 안티 폰 Willebrand Factor도 CAM의 혈관을 감지하는 데 사용되었습니다. TBST 버퍼로 채워진 세 개의 유리 큐벳을 준비하십시오. 일차 항체 용액을 붓고, 슬라이드를 유리 큐벳으로 옮기고, TBST에서 각각 5분 동안 적어도 3x 세척한다. 슬라이드에서 과량의 TBST를 제거하고 연종이 조직으로 소수성 장벽 영역에서 제거하십시오. 슬라이드를 4′,6-디아미디노-2-페닐인돌, 디히드로클로라이드 (DAPI)와 결합된 블로킹 용액에 희석된 적합한 2차 형광 항체의 100-150 μL로 표지하고 1시간 동안 RT에서 어둠 속에서 인큐베이션한다. 이차 항체 용액을 붓고, 슬라이드를 유리 큐벳으로 옮기고, TBST에서 각각 5분 동안 적어도 3x 세척한다. 슬라이드에서 과량의 TBST를 제거하고 연종이 조직으로 소수성 장벽 영역에서 제거하십시오. 슬라이드에 형광 장착 매체 1-2방울을 올려 슬라이드를 장착하고 유리 커버슬립을 부드럽게 올려 기포를 피합니다. 슬라이드를 분석하기 전에 4°C에서 적어도 1시간 동안 건조시키고, 슬라이드를 4°C로 보관한다. 10. 현미경 이미징 및 박리 점수 매기기 디지털 카메라가 장착된 에피형광 현미경을 사용하여, 바람직하게는 10x 배율로 단면을 촬영한다(도 1H). 다음 CAM-Delam 점수 매기기 범주를 사용하여 섹션을 분석합니다(그림 3). 눈에 보이는 변화없이 손상되지 않은 기본 라미나를 찾으십시오. 변경되었지만 손상되지 않은 기본 라미나를 찾으십시오. 세포 침범없이 손상된 기저 라미나를 찾으십시오. 세포 침범으로 손상된 기저 라미나를 찾으십시오.