Визуальная, одномолекулярная биохимия, изучаемая через микрофлюидные камеры, значительно облегчается с помощью стеклянной бочки, газонепроницаемых шприцев, стабильных соединений трубки с проточными клетками и устранения пузырьков путем размещения переключающих клапанов между шприцами и трубками. Протокол описывает двойные оптические ловушки, которые позволяют визуализировать транзакции ДНК и межмолекулярные взаимодействия.
Визуальная биохимия является мощным методом наблюдения стохастических свойств отдельных ферментов или ферментных комплексов, которые скрыты при усреднении, которое происходит в объемно-фазовых исследованиях. Для достижения визуализации двойные оптические пинцеты, где одна ловушка фиксирована, а другая подвижна, фокусируются в одном канале многопоточной микрофлюидной камеры, расположенной на ступени перевернутого флуоресцентного микроскопа. Оптический пинцет улавливает отдельные молекулы флуоресцентно меченой ДНК и жидкости, протекающей через камеру и мимо захваченных шариков, растягивает ДНК до В-формы (под минимальной силой, то есть 0 пН) с нуклеиновой кислотой, наблюдаемой в виде белой нити на черном фоне. Молекулы ДНК перемещаются из одного потока в другой, переводя стадию перпендикулярно потоку, чтобы обеспечить инициирование реакций контролируемым образом. Для достижения успеха микрофлюидные устройства с оптически чистыми каналами соединяют со стеклянными шприцами, удерживаемыми на месте в шприцевом насосе. Оптимальные результаты используют соединители, постоянно связанные с проточной ячейкой, трубки, которые являются механически жесткими и химически стойкими, и которые подключены к переключающим клапанам, которые устраняют пузырьки, препятствующие ламинарному потоку.
Способность визуализировать взаимодействия белка и ДНК на уровне одной молекулы и в режиме реального времени обеспечила значительное понимание стабильности генома 1,2. В дополнение к работе с отдельными молекулами ДНК по одной за раз, возможность просматривать транзакции между отдельными молекулами поблизости обеспечивает дополнительное понимание 3,4,5. Манипулирование дополнительными молекулами ДНК требует как дополнительных оптических ловушек, так и высококачественных, многоканальных, микрофлюидных проточных клеток6.
Существует несколько методов создания более одной оптической ловушки. К ним относятся сканирующие зеркала гальванометра, акустические оптические модуляторы и дифракционная оптика, которые генерируют голографический оптический пинцет 4,7,8,9. Часто сканирующие зеркала и акустические оптические модуляторы производят ловушки, которые делят время. В описанной здесь установке луч одного лазера Nd:YAG расщепляется на поляризацию, а затем лазерные сканирующие зеркала гальванометра контролируют положение того, что называется мобильной ловушкой (рисунок 1)4. Для облегчения позиционирования зеркал и фильтров для направления улавливающего луча на заднюю апертуру объектива микроскопа используется лазер HeNe. Это облегчает общее выравнивание, так как луч HeNe виден невооруженным глазом, в то время как инфракрасные лучи — нет. Луч HeNe также безопаснее для работы, что делает позиционирование зеркал и других компонентов менее напряженным. Первоначально путь луча для этого лазера отделен от луча 1064 нм, но вводится в тот же путь луча, а затем в объектив микроскопа. Как только физическое выравнивание достигнуто, позиционирование луча 1064 нм поверх луча HeNe выполняется, и это облегчается использованием инфракрасного средства просмотра и различных инструментов визуализации луча для визуализации положения и качества луча. Затем вводится расширитель луча, и полученный расширенный инфракрасный луч выравнивается по задней диафрагме объектива. Наконец, цель удаляется, а мощность в каждом поляризованном луче измеряется и регулируется с использованием волновых пластин λ/2, чтобы быть равной (рисунок 1C). Измерения мощности также выполняются после возврата цели, и обычно происходит потеря мощности 53%. Однако имеется достаточная мощность для формирования устойчивых фиксированных и движущихся оптических ловушек в фокальной плоскости (рисунок 1D).
Для получения изображений транзакций ДНК микрофлюидные проточные клетки играют ключевую роль, поскольку они позволяют проводить контролируемые измерения на уровне одной молекулы с высоким пространственным и временным разрешением (рисунок 2). Термин микрофлюидный относится к способности манипулировать жидкостями в одном или нескольких каналах с размерами от 5-500 мкмдо 10,11. Термин поток относится к фактической жидкости в канале, а канал относится к физическому каналу, в котором движется поток жидкости или потоки. Конструкция одноканальной проточной ячейки имеет общий физический канал, где наблюдаются реакции, и обычно присутствует только один поток жидкости. Таким образом, эти конструкции известны как однопоточные проточные ячейки. Напротив, многопоточные проточные ячейки определяются как микрофлюидное устройство, в котором два или более входных канала сходятся в один, общий, физический канал (рисунок 2A). В пределах общего канала потоки жидкости, которые исходят из отдельных каналов, текут параллельно друг другу и остаются разделенными с минимальным перемешиванием между ними, происходящим из-за диффузии (рисунок 2B). В большинстве экспериментальных установок один насос проталкивает жидкости в каждый канал с одинаковой скоростью. Напротив, когда используется граничное рулевое управление, три или более независимо управляемых насосов проталкивают жидкости через каналы. Однако каждый насос работает с разной скоростью, но чистый расход в общем канале постоянен12. Это позволяет быстро менять компоненты основного канала, просто изменяя скорость насоса.
В дополнение к ламинарному потоку, другим критическим фактором является профиль параболической скорости в ламинарном потоке жидкости. Самая высокая скорость потока происходит в середине потока, а самая медленная – рядом с поверхностями (рисунок 2C)13. Этот профиль должен рассматриваться как полностью растягивающий молекулу ДНК, которая прикреплена к шарику, удерживаемому в потоке, для точной визуализации флуоресцентной ДНК и точных одномолекулярных анализов. Здесь ДНК растягивается до В-формы и удерживается на месте под 0 пН силы. Для этого фокусировка положения оптической ловушки должна быть в положении 10-20 мкм от нижней поверхности крышки (рисунок 2D). Необходимо соблюдать осторожность, чтобы молекула ДНК не растягивалась за пределы В-формы, так как это может ингибировать ферментные реакции. В типичных буферных условиях 1 мкм = 3000 bp ДНК14. Кроме того, захватывая 10-20 мкм от покровного листа, комплекс ДНК позиционируется далеко от поверхности, тем самым сводя к минимуму поверхностные взаимодействия.
Многие методы были использованы для создания каналов микрофлюидных устройств, и они могут быть сделаны в лаборатории или проточные ячейки могут быть приобретены из коммерческих источников 6,15,16,17. Оптимальные материалы, используемые для построения проточных ячеек, должны быть механически жесткими, оптически прозрачными с низкой флуоресценцией и непроницаемыми для органических растворителей6. Часто боросиликатное флоат-стекло или плавленый кремнезем используются для обеспечения стабильной среды потока в течение длительного времени, которая подходит для оптического улавливания, визуализации и обнаружения силы. Эти материалы также позволяют использовать неводные растворители (например, спектрофотометрический метанол) для упрощения поверхностного смачивания и удаления пузырьков воздуха, а также денатуранты (например, 6M гуанидиния гидрохлорид) или моющие средства для очистки проточной ячейки. Наконец, методы, используемые для введения жидкостей в проточные ячейки, варьируются от сложных вакуумных насосных систем до насосов с одним шприцем 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. В описанном здесь подходе используется шприцевой насос, который может вместить до 10 шприцев (рисунок 3А). Это обеспечивает гибкость при использовании одноканальных проточных ячеек или проточных ячеек с несколькими входными каналами. Здесь используется трехканальная проточная ячейка, которая соединена со шприцами, удерживаемыми на месте на шприцевом насосе с использованием трубки поли-эфир-эфир-кетон (PEEK) (рисунок 3A-C). Поток жидкостей контролируется четырехходовыми переключающими клапанами и, таким образом, служит для минимизации введения пузырьков в проточную ячейку (рисунок 3A,D). Кроме того, рекомендуются газонепроницаемые шприцы Hamilton, которые имеют жесткие стеклянные стенки и плунжеры с политетрафторэтиленовым (PTFE) покрытием, поскольку они обеспечивают исключительно плавное движение плунжера, что необходимо для получения плавного потока14,27.
В описанной экспериментальной системе использовались проточные ячейки с двумя-пятью входными каналами. Количество входных каналов диктуется проводимым экспериментом. Для исследования RecBCD и Hop2-Mnd1 было достаточно двух потоковых каналов14,28. Для геликазы фермент связывали со свободным концом ДНК и переводили в поток, содержащий магний и АТФ, чтобы инициировать транслокацию и раскручивание. Для Hop2-Mnd1 оптически захваченную ДНК переводили в соседний поток жидкости, содержащий белки и буферные ± двухвалентных ионов металлов. Использование трехканальных проточных клеток позволяет улавливать ДНК в потоке 1, переводить ДНК в поток 2, чтобы обеспечить связывание белка, а затем в поток 3, где присутствует АТФ, например, инициировать реакции. Вариацией вышесказанного является использование флуоресцентного помеченного белка в канале 2, что приводит к тому, что поток жидкости становится полностью белым и исключает визуализацию ДНК. Когда эта молекула транслируется в поток 3, и белки, и ДНК теперь видны, когда инициируются реакции.
Использование четырехходовых переключающих клапанов для управления потоком жидкости является критически важным компонентом системы для устранения пузырьков в проточных ячейках. Пузырьки наносят ущерб стабильному потоку жидкости, поскольку они сжимаются и расширяются непредсказуемым образом, что приводит к быстрым изменениям скорости потока и введению турбулентности. Когда клапаны расположены между шприцами и впускными трубками, путь потока отключается путем переключения положения клапана при смене шприцев. Когда новый шприц установлен на место, плунжер может быть вручную нажат, так что >6 мкл выбрасывается (мертвый объем клапана), и это почти полностью устраняет пузырьки.
Прикрепление соединителей к проточным ячейкам часто является шагом, ограничивающим скорость использования проточной ячейки. Описано использование двух типов разъемов: съемных, известных как press-fit, и постоянных (нанопортовых сборок). Съемные разъемы легко прикрепляются к проточной ячейке, и различные типы гибких трубок в дополнение к рекомендуемому PTFE могут быть протестированы с этими разъемами. Это быстрый и экономичный способ тестирования трубок и соединителей без ущерба для более дорогих стеклянных проточных ячеек. Напротив, нанопортовые сборки крепятся постоянно, выдерживают давление до 1000 фунтов на квадратный дюйм, и, в наших руках, их использование ограничено трубками PEEK разных диаметров. Это не является недостатком, так как предпочтительно использовать трубки PEEK. Одна стеклянная проточная ячейка с прикрепленными постоянными узлами может быть повторно использована более 1 года при тщательном использовании.
Тщательная сборка системы потока имеет решающее значение для успешного исхода экспериментов 4,6. Одним из наиболее сложных аспектов протокола является прикрепление разъемов к поверхности стекла. Для этого мы используем следующие два подхода: прижимные ?…
The authors have nothing to disclose.
Исследования в лаборатории Bianco поддерживаются грантами NIH GM100156 и GM144414 P.R.B.
100x objective | Leica | 506318 or 506038 | Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging |
10X Objective | Leica | 506263 | Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell |
1 mm fluorescent beads | Bangs Labs | FSDG004 | Used for tap performance, focal position determination |
1 mm polystyrene beads | Bangs Labs | CPO1004 | Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules |
63x objective | Leica | 506081 | Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens |
Alignment laser | Lumentum | 1100 series | 10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics |
Beam alignment camera | Amscope | MU303 | A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position |
Camera control and Image capture software | Hamamatsu | HCImage | Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching |
Camera; Orca flash 4 | Hamamatsu | c13440-20cu | CCD camera for imaging of single-molecule experiments |
C-mount for the beam alignment camera | Spot imaging solutions | DE50CMT | Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment |
C-mount for the Orca Flash 4 camera | Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects. | ||
Cy5 fluorescence filter cube | Semrock | cy5-404a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only |
Fitc-Txred fluorescence filter cube | Semrock | fitc/txred-2x-b-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed |
Fluidics tubing | Grace Bio | 46004 | PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used |
GFP fluorescence filter cube | Semrock | gfp-3035b-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only |
Glass flow cells | Translume | Custom | Clear flow channels for imaging (Fig. 2E) |
Glass glue | Loctite | 233841 | Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells |
Glass/PDMS sandwich flow cells | CIDRA Precision services | Custom design | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C) |
Hamilton Cleaning solution | Hamilton | 18311 | Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully |
Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
Image analysis software | Media cybernetics | Image Pro Premiere | Analysis of images and single molecule tracking |
Image analysis software | Fiji/NIH Image/Image J | Shareware | Analysis of images and single molecule tracking |
Image display card | Melles Griot | 06 DLA 001 | Alternate product from Thorlabs: VRC5 |
Immersion oil | Zeiss | 444960 | Immersol 518 F fluorescence free |
Laser beam alignment tools | Thor labs | FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1 | Used to ensure beams are horizontal and at the correct height |
Laser beam viewer | Canadian Photonics labs | IR 3150 | Used to image IR beam spots on mirrors and targets |
Laser power meter | Thor labs | Measurement of laser output as well as trap strength | |
Laser safety glasses (HeNe) | Thor labs | LG7 or 8 | Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm |
Laser safety glasses (IR) | Thor labs | LG11 | Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm |
Mcherry fluorescence filter cube | Semrock | mcherry-a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only |
Microscope | Leica | DMIRE2 | DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror |
Microscope control software | UCSF/shareware | uManager | Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control |
Nanoport assembly | IDEX | N333 | Connectors that are bonded to flow cells |
Optical table support | Thor Labs | PA52502 | Active isolation table support |
Optics and lenses | Solar TII | Various | Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system |
PDMS flow cells | ufluidix | Custom | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D) |
PEEK tubing | IDEX | 1532 | Provides excellent connection to flow cells and switching valves |
Pinkel fluorescence filter cube | Semrock | lf488/543/635-3x-a-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly |
Press fit tubing connectors | GraceBio | 46003 | Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass |
Scanning mirrors | GSI Lumonics | VM500 | Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific |
Stage | Leica | ||
Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 68042-08 | Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration |
Switching valves | IDEX | V-101T | Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells |
Syringe and valve manifold | Machine shop | None | Custom built |
Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Controls fluid flow through flow cells |
Syringe pump software | Harvard Apparatus | 70-6000 | Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow |
Syringes | Hamilton | 81320 | Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers |
Table top | Thor Labs | T36H | Optical table top or breadboard |
Trapping laser | Newport/Spectra Physics | J-series; BL106C | Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser |