Summary

Использование двойного оптического пинцета и микрофлюидики для исследований одной молекулы

Published: November 18, 2022
doi:

Summary

Визуальная, одномолекулярная биохимия, изучаемая через микрофлюидные камеры, значительно облегчается с помощью стеклянной бочки, газонепроницаемых шприцев, стабильных соединений трубки с проточными клетками и устранения пузырьков путем размещения переключающих клапанов между шприцами и трубками. Протокол описывает двойные оптические ловушки, которые позволяют визуализировать транзакции ДНК и межмолекулярные взаимодействия.

Abstract

Визуальная биохимия является мощным методом наблюдения стохастических свойств отдельных ферментов или ферментных комплексов, которые скрыты при усреднении, которое происходит в объемно-фазовых исследованиях. Для достижения визуализации двойные оптические пинцеты, где одна ловушка фиксирована, а другая подвижна, фокусируются в одном канале многопоточной микрофлюидной камеры, расположенной на ступени перевернутого флуоресцентного микроскопа. Оптический пинцет улавливает отдельные молекулы флуоресцентно меченой ДНК и жидкости, протекающей через камеру и мимо захваченных шариков, растягивает ДНК до В-формы (под минимальной силой, то есть 0 пН) с нуклеиновой кислотой, наблюдаемой в виде белой нити на черном фоне. Молекулы ДНК перемещаются из одного потока в другой, переводя стадию перпендикулярно потоку, чтобы обеспечить инициирование реакций контролируемым образом. Для достижения успеха микрофлюидные устройства с оптически чистыми каналами соединяют со стеклянными шприцами, удерживаемыми на месте в шприцевом насосе. Оптимальные результаты используют соединители, постоянно связанные с проточной ячейкой, трубки, которые являются механически жесткими и химически стойкими, и которые подключены к переключающим клапанам, которые устраняют пузырьки, препятствующие ламинарному потоку.

Introduction

Способность визуализировать взаимодействия белка и ДНК на уровне одной молекулы и в режиме реального времени обеспечила значительное понимание стабильности генома 1,2. В дополнение к работе с отдельными молекулами ДНК по одной за раз, возможность просматривать транзакции между отдельными молекулами поблизости обеспечивает дополнительное понимание 3,4,5. Манипулирование дополнительными молекулами ДНК требует как дополнительных оптических ловушек, так и высококачественных, многоканальных, микрофлюидных проточных клеток6.

Существует несколько методов создания более одной оптической ловушки. К ним относятся сканирующие зеркала гальванометра, акустические оптические модуляторы и дифракционная оптика, которые генерируют голографический оптический пинцет 4,7,8,9. Часто сканирующие зеркала и акустические оптические модуляторы производят ловушки, которые делят время. В описанной здесь установке луч одного лазера Nd:YAG расщепляется на поляризацию, а затем лазерные сканирующие зеркала гальванометра контролируют положение того, что называется мобильной ловушкой (рисунок 1)4. Для облегчения позиционирования зеркал и фильтров для направления улавливающего луча на заднюю апертуру объектива микроскопа используется лазер HeNe. Это облегчает общее выравнивание, так как луч HeNe виден невооруженным глазом, в то время как инфракрасные лучи — нет. Луч HeNe также безопаснее для работы, что делает позиционирование зеркал и других компонентов менее напряженным. Первоначально путь луча для этого лазера отделен от луча 1064 нм, но вводится в тот же путь луча, а затем в объектив микроскопа. Как только физическое выравнивание достигнуто, позиционирование луча 1064 нм поверх луча HeNe выполняется, и это облегчается использованием инфракрасного средства просмотра и различных инструментов визуализации луча для визуализации положения и качества луча. Затем вводится расширитель луча, и полученный расширенный инфракрасный луч выравнивается по задней диафрагме объектива. Наконец, цель удаляется, а мощность в каждом поляризованном луче измеряется и регулируется с использованием волновых пластин λ/2, чтобы быть равной (рисунок 1C). Измерения мощности также выполняются после возврата цели, и обычно происходит потеря мощности 53%. Однако имеется достаточная мощность для формирования устойчивых фиксированных и движущихся оптических ловушек в фокальной плоскости (рисунок 1D).

Для получения изображений транзакций ДНК микрофлюидные проточные клетки играют ключевую роль, поскольку они позволяют проводить контролируемые измерения на уровне одной молекулы с высоким пространственным и временным разрешением (рисунок 2). Термин микрофлюидный относится к способности манипулировать жидкостями в одном или нескольких каналах с размерами от 5-500 мкмдо 10,11. Термин поток относится к фактической жидкости в канале, а канал относится к физическому каналу, в котором движется поток жидкости или потоки. Конструкция одноканальной проточной ячейки имеет общий физический канал, где наблюдаются реакции, и обычно присутствует только один поток жидкости. Таким образом, эти конструкции известны как однопоточные проточные ячейки. Напротив, многопоточные проточные ячейки определяются как микрофлюидное устройство, в котором два или более входных канала сходятся в один, общий, физический канал (рисунок 2A). В пределах общего канала потоки жидкости, которые исходят из отдельных каналов, текут параллельно друг другу и остаются разделенными с минимальным перемешиванием между ними, происходящим из-за диффузии (рисунок 2B). В большинстве экспериментальных установок один насос проталкивает жидкости в каждый канал с одинаковой скоростью. Напротив, когда используется граничное рулевое управление, три или более независимо управляемых насосов проталкивают жидкости через каналы. Однако каждый насос работает с разной скоростью, но чистый расход в общем канале постоянен12. Это позволяет быстро менять компоненты основного канала, просто изменяя скорость насоса.

В дополнение к ламинарному потоку, другим критическим фактором является профиль параболической скорости в ламинарном потоке жидкости. Самая высокая скорость потока происходит в середине потока, а самая медленная – рядом с поверхностями (рисунок 2C)13. Этот профиль должен рассматриваться как полностью растягивающий молекулу ДНК, которая прикреплена к шарику, удерживаемому в потоке, для точной визуализации флуоресцентной ДНК и точных одномолекулярных анализов. Здесь ДНК растягивается до В-формы и удерживается на месте под 0 пН силы. Для этого фокусировка положения оптической ловушки должна быть в положении 10-20 мкм от нижней поверхности крышки (рисунок 2D). Необходимо соблюдать осторожность, чтобы молекула ДНК не растягивалась за пределы В-формы, так как это может ингибировать ферментные реакции. В типичных буферных условиях 1 мкм = 3000 bp ДНК14. Кроме того, захватывая 10-20 мкм от покровного листа, комплекс ДНК позиционируется далеко от поверхности, тем самым сводя к минимуму поверхностные взаимодействия.

Многие методы были использованы для создания каналов микрофлюидных устройств, и они могут быть сделаны в лаборатории или проточные ячейки могут быть приобретены из коммерческих источников 6,15,16,17. Оптимальные материалы, используемые для построения проточных ячеек, должны быть механически жесткими, оптически прозрачными с низкой флуоресценцией и непроницаемыми для органических растворителей6. Часто боросиликатное флоат-стекло или плавленый кремнезем используются для обеспечения стабильной среды потока в течение длительного времени, которая подходит для оптического улавливания, визуализации и обнаружения силы. Эти материалы также позволяют использовать неводные растворители (например, спектрофотометрический метанол) для упрощения поверхностного смачивания и удаления пузырьков воздуха, а также денатуранты (например, 6M гуанидиния гидрохлорид) или моющие средства для очистки проточной ячейки. Наконец, методы, используемые для введения жидкостей в проточные ячейки, варьируются от сложных вакуумных насосных систем до насосов с одним шприцем 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. В описанном здесь подходе используется шприцевой насос, который может вместить до 10 шприцев (рисунок 3А). Это обеспечивает гибкость при использовании одноканальных проточных ячеек или проточных ячеек с несколькими входными каналами. Здесь используется трехканальная проточная ячейка, которая соединена со шприцами, удерживаемыми на месте на шприцевом насосе с использованием трубки поли-эфир-эфир-кетон (PEEK) (рисунок 3A-C). Поток жидкостей контролируется четырехходовыми переключающими клапанами и, таким образом, служит для минимизации введения пузырьков в проточную ячейку (рисунок 3A,D). Кроме того, рекомендуются газонепроницаемые шприцы Hamilton, которые имеют жесткие стеклянные стенки и плунжеры с политетрафторэтиленовым (PTFE) покрытием, поскольку они обеспечивают исключительно плавное движение плунжера, что необходимо для получения плавного потока14,27.

В описанной экспериментальной системе использовались проточные ячейки с двумя-пятью входными каналами. Количество входных каналов диктуется проводимым экспериментом. Для исследования RecBCD и Hop2-Mnd1 было достаточно двух потоковых каналов14,28. Для геликазы фермент связывали со свободным концом ДНК и переводили в поток, содержащий магний и АТФ, чтобы инициировать транслокацию и раскручивание. Для Hop2-Mnd1 оптически захваченную ДНК переводили в соседний поток жидкости, содержащий белки и буферные ± двухвалентных ионов металлов. Использование трехканальных проточных клеток позволяет улавливать ДНК в потоке 1, переводить ДНК в поток 2, чтобы обеспечить связывание белка, а затем в поток 3, где присутствует АТФ, например, инициировать реакции. Вариацией вышесказанного является использование флуоресцентного помеченного белка в канале 2, что приводит к тому, что поток жидкости становится полностью белым и исключает визуализацию ДНК. Когда эта молекула транслируется в поток 3, и белки, и ДНК теперь видны, когда инициируются реакции.

Использование четырехходовых переключающих клапанов для управления потоком жидкости является критически важным компонентом системы для устранения пузырьков в проточных ячейках. Пузырьки наносят ущерб стабильному потоку жидкости, поскольку они сжимаются и расширяются непредсказуемым образом, что приводит к быстрым изменениям скорости потока и введению турбулентности. Когда клапаны расположены между шприцами и впускными трубками, путь потока отключается путем переключения положения клапана при смене шприцев. Когда новый шприц установлен на место, плунжер может быть вручную нажат, так что >6 мкл выбрасывается (мертвый объем клапана), и это почти полностью устраняет пузырьки.

Прикрепление соединителей к проточным ячейкам часто является шагом, ограничивающим скорость использования проточной ячейки. Описано использование двух типов разъемов: съемных, известных как press-fit, и постоянных (нанопортовых сборок). Съемные разъемы легко прикрепляются к проточной ячейке, и различные типы гибких трубок в дополнение к рекомендуемому PTFE могут быть протестированы с этими разъемами. Это быстрый и экономичный способ тестирования трубок и соединителей без ущерба для более дорогих стеклянных проточных ячеек. Напротив, нанопортовые сборки крепятся постоянно, выдерживают давление до 1000 фунтов на квадратный дюйм, и, в наших руках, их использование ограничено трубками PEEK разных диаметров. Это не является недостатком, так как предпочтительно использовать трубки PEEK. Одна стеклянная проточная ячейка с прикрепленными постоянными узлами может быть повторно использована более 1 года при тщательном использовании.

Protocol

1. Выравнивание и тестирование лазерной ловушки с полистирольными шариками ПРИМЕЧАНИЕ: Для установки обратитесь к рисунку 1A,B. ВНИМАНИЕ: Экспериментатор должен носить соответствующие защитные очки или лазерные защитные о?…

Representative Results

Первоначальные испытания выравнивания и прочности ловушки проводятся с помощью 1 мкм, нефлуоресцентных полистирольных шариков. Поскольку большая часть исследований, проведенных в лаборатории, использует флуоресценцию, мы дополнительно проверяем прочность ловушки с использованием 1 …

Discussion

Тщательная сборка системы потока имеет решающее значение для успешного исхода экспериментов 4,6. Одним из наиболее сложных аспектов протокола является прикрепление разъемов к поверхности стекла. Для этого мы используем следующие два подхода: прижимные ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Исследования в лаборатории Bianco поддерживаются грантами NIH GM100156 и GM144414 P.R.B.

Materials

100x objective Leica 506318 or 506038 Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging
10X Objective Leica 506263 Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell
1 mm fluorescent beads Bangs Labs FSDG004 Used for tap performance, focal position determination
1 mm polystyrene beads Bangs Labs CPO1004 Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules
63x objective Leica 506081 Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens
Alignment laser Lumentum 1100 series 10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics
Beam alignment camera Amscope MU303 A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position
Camera control and Image capture software Hamamatsu HCImage Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching
Camera; Orca flash 4 Hamamatsu c13440-20cu CCD camera for imaging of single-molecule experiments
C-mount for the beam alignment camera Spot imaging solutions DE50CMT Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment
C-mount for the Orca Flash 4 camera Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects.
Cy5  fluorescence filter cube Semrock cy5-404a-lsc-zero Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only
Fitc-Txred  fluorescence filter cube Semrock fitc/txred-2x-b-000 Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed
Fluidics tubing Grace Bio 46004 PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used
GFP fluorescence filter cube Semrock gfp-3035b-lsc-zero Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only
Glass flow cells Translume Custom Clear flow channels for imaging (Fig. 2E)
Glass glue Loctite 233841 Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells
Glass/PDMS sandwich flow cells CIDRA Precision services Custom design Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C)
Hamilton Cleaning solution Hamilton 18311 Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully
Illumination system Sutter Instrument Lamda DG4 Discontinued so recommend Lambda 721
Illumination system Sutter Instrument Lamda DG4 Discontinued so recommend Lambda 721
Image analysis software Media cybernetics Image Pro Premiere Analysis of images and single molecule tracking
Image analysis software Fiji/NIH Image/Image J Shareware Analysis of images and single molecule tracking
Image display card Melles Griot 06 DLA 001 Alternate product from Thorlabs: VRC5
Immersion oil Zeiss 444960 Immersol 518 F fluorescence free
Laser beam alignment tools Thor labs FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1  Used to ensure beams are horizontal and at the correct height
Laser beam viewer Canadian Photonics labs IR 3150 Used to image IR beam spots on mirrors and  targets
Laser power meter Thor labs Measurement of laser output as well as trap strength
Laser safety glasses (HeNe) Thor labs LG7 or 8 Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm
Laser safety glasses (IR) Thor labs LG11 Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm
Mcherry  fluorescence filter cube Semrock mcherry-a-lsc-zero Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only
Microscope Leica DMIRE2 DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror
Microscope control software  UCSF/shareware uManager Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control
Nanoport assembly IDEX N333 Connectors that are bonded to flow cells
Optical table support Thor Labs PA52502 Active isolation table support
Optics and lenses Solar TII Various Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system
PDMS flow cells ufluidix Custom Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D)
PEEK tubing IDEX 1532 Provides excellent connection to flow cells and switching valves
Pinkel fluorescence filter cube Semrock lf488/543/635-3x-a-000 Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly
Press fit tubing connectors GraceBio 46003 Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass
Scanning mirrors GSI Lumonics VM500 Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific
Stage Leica
Stage micrometer Electron Microscopy Sciences 68042-08 Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration
Switching valves IDEX V-101T Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells
Syringe and valve manifold Machine shop None Custom built
Syringe pump Harvard Apparatus PHD 2000 Controls fluid flow through flow cells
Syringe pump software Harvard Apparatus 70-6000 Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow
Syringes Hamilton 81320 Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers
Table top Thor Labs T36H Optical table top or breadboard
Trapping laser Newport/Spectra Physics J-series; BL106C Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser

References

  1. Bianco, P. R., Lu, Y. Single-molecule insight into stalled replication fork rescue in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4220-4238 (2021).
  2. Kaur, G., Lewis, J. S., van Oijen, A. M. Shining a spotlight on DNA: Single-molecule methods to visualise DNA. Molecules. 24 (3), 491 (2019).
  3. Dame, R. T., Noom, M. C., Wuite, G. J. Bacterial chromatin organization by H-NS protein unravelled using dual DNA manipulation. Nature. 444 (7117), 387-390 (2006).
  4. Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
  5. Amitani, I., Liu, B., Dombrowski, C. C., Baskin, R. J., Kowalczykowski, S. C. Watching individual proteins acting on single molecules of DNA. Methods in Enzymology. 472, 261-291 (2010).
  6. Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
  7. Visscher, K., Brakenhoff, G. J., Krol, J. J. Micromanipulation by multiple optical traps created by a single fast scanning trap integrated with the bilateral Confocal scanning laser microscope. Cytometry. 14, 105-114 (1993).
  8. Vermeulen, K. C., Mameren, J. v. Calibrating bead displacements in optical tweezers using acousto-optic deflectors. Review of Scientific Instruments. 77 (1), 013704 (2006).
  9. Dufresne, E. R. Computer-generated holographic optical tweezers arrays. Review of Scientific Instruments. 72 (3), 1810 (2001).
  10. Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77, 977-1026 (2005).
  11. Weibel, D. B., Whitesides, G. M. Applications of microfluidics in chemical biology. Current Opinion in Chemical Biology. 10 (6), 584-591 (2006).
  12. Tan, X., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. DNA transposition target immunity and the determinants of the MuB distribution patterns on DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13925-13929 (2007).
  13. Lima, R., Wada, S., Takeda, M., Tsubota, K., Yamaguchi, T. In vitro confocal micro-PIV measurements of blood flow in a square microchannel: the effect of the haematocrit on instantaneous velocity profiles. Journal of Biomechanics. 40 (12), 2752-2757 (2007).
  14. Bianco, P. R., et al. Processive translocation and DNA unwinding by individual RecBCD enzyme molecules. Nature. 409 (6818), 374-378 (2001).
  15. Forget, A. L., Dombrowski, C. C., Amitani, I., Kowalczykowski, S. C. Exploring protein-DNA interactions in 3D using in situ construction, manipulation and visualization of individual DNA dumbbells with optical traps, microfluidics and fluorescence microscopy. Nature Protocol. 8 (3), 525-538 (2013).
  16. Streets, A. M., Huang, Y. Microfluidics for biological measurements with single-molecule resolution. Current Opinion in Biotechnology. 25, 69-77 (2014).
  17. Madariaga-Marcos, J., Corti, R., Hormeno, S., Moreno-Herrero, F. Characterizing microfluidic approaches for a fast and efficient reagent exchange in single-molecule studies. Scientific Reports. 10 (1), 18069 (2020).
  18. Grayson, P., Han, L., Winther, T., Phillips, R. Real-time observations of single bacteriophage lambda DNA ejections in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (37), 14652-14657 (2007).
  19. Luo, G., Wang, M., Konigsberg, W. H., Xie, X. S. Single-molecule and ensemble fluorescence assays for a functionally important conformational change in T7 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12610-12615 (2007).
  20. Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).
  21. Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79 (2), 1155-1167 (2000).
  22. Kim, S., Blainey, P. C., Schroeder, C. M., Xie, X. S. Multiplexed single-molecule assay for enzymatic activity on flow-stretched DNA. Nature Methods. 4 (5), 397-399 (2007).
  23. Tanaka, H., Ishijima, A., Honda, M., Saito, K., Yanagida, T. Orientation dependence of displacements by a single one-headed myosin relative to the actin filament. Biophysical Journal. 75 (4), 1886-1894 (1998).
  24. Merenda, F., Andrews, D. L., Galves, E. J., Nienhuis, G., et al. Refractive multiple optical tweezers for parallel biochemical analysis in micro-fluidics. Proceeding of SPIE. , 6483 (2007).
  25. Brewer, L. R., Corzett, M., Balhorn, R. Protamine-induced condensation and decondensation of the same DNA molecule. Science. 286 (5437), 120-123 (1999).
  26. Ladoux, B., Quivy, J. P., Doyle, P. S., Almouzni, G., Viovy, J. L. Direct imaging of single-molecules: from dynamics of a single DNA chain to the study of complex DNA-protein interactions. Science Progress. 84, 267-290 (2001).
  27. Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
  28. Pezza, R. J., Camerini-Otero, R. D., Bianco, P. R. Hop2-Mnd1 condenses DNA to stimulate the synapsis phase of DNA strand exchange. Biophysical Journal. 99 (11), 3763-3772 (2010).
  29. Rye, H. S., et al. Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes: properties and applications. Nucleic Acids Research. 20 (11), 2803-2812 (1992).

Play Video

Cite This Article
Bianco, P. R. Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies. J. Vis. Exp. (189), e64023, doi:10.3791/64023 (2022).

View Video