Характеристика одноклеточного везикулярного трансмембранного белка с помощью нанопоточной цитометрии

Детали образцов и реагентов
Два изолята EV из отдельных клеточных линий были выбраны для демонстрации флуоресцентной маркировки и последующего анализа nFCM. Оба набора EV были приостановлены в PBS и хранились при -80 ° C в течение <3 месяцев, но большинство других условий отличались между изолятами. Клеточная линия миобласта мыши C2C12 представляет собой эмбриональный предшественник клеток скелетных мышц и была выращена в 2D-культуре, обусловливая питательную среду в течение 72 ч до выделения EV ультрацентрифугированием. SW620 представляет собой клеточную линию аденокарциномы толстой кишки человека и был выращен в рудиментарном биореакторе, обогащающем среду в течение 7 недель, с изоляцией EV, проводимой с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC) и фракций 7-9 элюированных из колонок сефарозы CL-2B, объединенных в один образец.

В то время как ev, выделенные и концентрированные из CCM, являются самыми простыми типами образцов для работы, nFCM применим к большинству изолятов EV, включая биожидкости, такие как сыворотка, плазма, моча и CSF. Эти анализы образцов выигрывают от обнаружения nFCM SS всех частиц, что позволяет подтверждать их анализом NTA, TRPS и другими частицами, описывая флуоресцентно меченые субпопуляции EV в количественном выражении, а также долю от общего числа, для непредвзятого подхода к анализу многопараметрических частиц. Анализ образцов с низкой степенью обработки также возможен, таких как неочищенная моча и обогащенный EV CCM с оговоркой о необходимости низкого содержания загрязняющего белка.

Мембранный краситель, используемый здесь, предназначен для интеграции в липидный бислой, с липофильным фрагментом для мембранной нагрузки и гидрофильным красителем для пребывания в плазматической мембране²⁵. В настоящее время не существует идеального красителя для маркировки электромобилей, и при выборе необходимо учитывать несколько критериев, включая специфичность для электромобилей, пригодность с фиксацией или проникновением и эффективность маркировки^{EV 26}.

Флуоресцентная конъюгированная маркировка антител поверхностных эпитопов оказалась эффективным методом идентификации субпопуляций EV²⁷. Ключевым аспектом оптимизации протокола является соблюдение и не превышение точки насыщения маркировки для связывания со всеми доступными эпитопами без ингибирования обнаружения частиц с низкой флуоресценцией, позволяя заполнению окружающего буфера флуоресцентным несвязанным антителом²⁸. Кроме того, наличие открытых сайтов связывания для маркировки антител потенциально зависит от нескольких факторов. Было показано, что условия хранения EV влияют на профили концентрации и размера EV²⁹ с наблюдениями, также указывающими на влияние на маркировку антител³⁰. Присутствие поверхностных белков короны, модификации белка и влияние методов выделения также могут оказывать влияние на маркировку антител в некоторых случаях. В конечном счете, поскольку использование флуоресцентной маркировки становится все более распространенным для исследований электромобилей, экспериментальное проектирование и оптимизация для нескольких аналитических методов станут более совершенными.

Для повышения точности результатов могут быть включены несколько контрольных элементов, таких как (1) контроль PBS + красителя, для оценки образования мицелл или агрегатов в некоторых красителях, которые могут появляться в виде частиц SS + в анализе nFCM, (2) PBS + контроль антител, агрегаты могут возникать, хотя часто недостаточно большие, чтобы рассеивать достаточно света для обнаружения SS, (3) образец EV + контроль антител IgG, распространенный в проточной цитометрии и используемый для идентификации любого неспецифического связывания, (4) образец частиц без EV + контроль антител / красителя – особенно важен при необходимости идентификации EV в сложных образцах частиц, такие элементы контроля, как очищенные частицы липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) или образцы с обедненными / абляционными образцами EV, могут выступать в качестве отрицательного контроля для проверки селективной маркировки, (5) положительные контрольные элементы управления трудно спроектировать, но валидация антитела на клетках является полезным включением.

Презентация тетраспанинов на электромобилях
Маркировка антител и мембран этого эксперимента демонстрирует высокий уровень количественных данных, которые могут быть получены в небольшой промежуток времени путем анализа nFCM. Одновременное измерение ключевых физических атрибутов диаметра/концентрации частиц с фенотипическими измерениями присутствия мембраны и/или белка приводит к высокоуровневым описаниям субпопуляций в изоляции частиц.

Важно отметить, что различные уровни трех «ключевых» тетраспанинов, связанных с EV, CD9, CD63, CD81, были идентифицированы в этих двух образцах EV. CD9 был представлен на наибольшей доле EV как для EV, полученных из C2C12, так и для SW620, причем CD81 и CD63 являются вторыми и наименее представленными белками соответственно.

Несмотря на некоторые сходства, наблюдаемые здесь в тетраспаниновых профилях EV из двух очень разных клеточных источников, уровни CD9, CD63 и CD81 могут сильно различаться между клеточной линией и полученными от пациента EV³¹.

Разница в выражении CD63 между двумя образцами EV особенно актуальна для продолжающегося обсуждения ключевых идентификаторов «EV-ness». В то время как представление CD63 только в ~ 8% электромобилей SW620 может быть неожиданным для некоторых, CD63 был предложен в качестве плохого идентификатора различных типов EV, выделенных по размеру или плотности³², и тетраспанин отрицательные EV были идентифицированы, даже если они описаны как экзосомоподобные³³.

Идентификация электромобилей в сложных изоляциях частиц
Гетерогенность профилей тетраспанина EV, как в клеточной линии, так и в EV, полученных от пациентов, предостерегает от зависимости от захвата EV на основе тетраспанина и подчеркивает будущую потребность в новых методах идентификации EV³¹. Маркировка EV независимо от конкретных белков может оказаться очень полезной для идентификации EV из частиц аналогичного размера, не относящихся к EV, если можно доказать, что специфичность EV очень высока. Это особенно верно для изолятов биожидких EV, поскольку было высказано предположение, что концентрация EV в плазме крови человека находится в диапазоне 10¹⁰ частиц / мл, в то время как липопротеины измеряются на уровне 10¹⁶ на мл^14,34. Даже при обогащении EV исследования, сравнивающие положительность частиц для маркеров тетраспанина и / или маркера ЛПНП ApoB, предполагают ~ 50-100 раз большее содержание ЛПНП в образцах плазмы без тромбоцитов (PFP) по сравнению с EV³⁵.

Используемый метод изоляции значительно влияет на диапазон совместно изолированных частиц, не связанных с EV, таких как липопротеины очень низкой плотности (VLDL), липопротеины средней плотности (IDL) и^{LDL 36}. Существуют также описания коизолятов липопротеинов, связанных с EV, которые, хотя потенциально играют важную биологическую роль, делают достижение чистых образцов EV сложной целью³⁵.

Поэтому можно утверждать, что больше внимания следует уделять описанию частиц, составляющих образец, а не достижению изоляции чистого, но ограниченного выбора электромобилей. Достижение всестороннего описания частиц путем измерения содержания тетраспанина в объеме и количества частиц по отдельности может быть недостаточным для точного определения концентраций EV, особенно из источников биотекучей^{жидкости 36,37}. Идентификация субпопуляций в многоуровневом подходе, показывающая общие частицы, EV и EV, представляющие определенные белки, как показано в этом эксперименте, может обеспечить надежное решение для характеристики наночастиц. Это относится к проектам, связанным с загрузкой электромобилей с конструкциями для будущих терапевтических применений²⁰ и идентификацией CD63 + EV с просветным грузом, таким как митохондрии³⁸.

nFCM в репертуаре EV аналитики
Сильной стороной анализа nFCM EV является то, как данные могут подтверждать и основываться на наиболее распространенных анализах EV и формировать мосты между физическими и фенотипическими наборами данных. Тем не менее, это основано на точных протоколах маркировки, которые часто необходимо оптимизировать для уникальных реагентов маркировки, таких как красители и антитела. Ключевым критерием для точного анализа является наличие меченых частиц, взвешенных в нефлуоресцентном буфере, который опирается либо на удаление избытка несвязанного флуорофора, либо на уточнение протоколов, чтобы не превышать насыщение эпитопом.

Сравнительные исследования показали, что nFCM калибровка электромобилей обеспечивает данные в соответствии с TRPS и крио-ТЭМ, методами, которые описываются как более точные, чем NTA для анализа размера EV^10,39. Однако, как и в случае с любым оптическим методом, влияние гетерогенных оптических свойств, наблюдаемых для электромобилей, и различия между оптическими свойствами эталонного материала и ev должны быть признаны при интерпретации данных¹⁰.

Вестерн-блоттинг был ключевым методом для индикации обогащения EV путем идентификации маркеров^{EV 40}. Но желание продемонстрировать присутствие таких маркеров на частицах привело к прогрессу в цитометрическом анализе потока на основе^EV17. Однако необходимые разрешения для предоставления надежных данных в настоящее время лучше всего достигаются с помощью специальных приборов в отношении как рассеянного, так и флуоресцентного света¹⁹.

nFCM обеспечивает непредвзятый подход к первоначальному описанию всех частиц, не имеющих отношения к конкретным маркерам, с использованием измерения бокового рассеяния, что позволяет подтвердить наиболее распространенные методы NTA, RPS и TEM¹, одновременно добавляя фенотипические измерения, аналогичные WB или Elisa в количественном виде.