Afstamming Tracering van induceerbare fluorescerend gelabelde stamcellen in het volwassen muizenbrein

Waarde van een afstammingsmuislijn
Analyse van stamcellen in vivo kan moeilijk zijn, omdat veel testen die dergelijke cellen onderzoeken zich alleen richten op het karakteriseren van deze cellen op het moment van overlijden van het dier, wat een terminale momentopname in de tijd vertegenwoordigt. Om de processen van proliferatie, differentiatie en migratie van voorlopercellen, intermediaire / overgangsceltypen en volwassen cellen in de loop van de tijd beter te begrijpen, is een longitudinale analysebenadering vereist. Dit kan worden bereikt met afstammingstraceringsstudies waarbij stam-/voorlopercellen onuitwisbaar worden gemarkeerd en daarna gedurende elke tijd kunnen worden gevolgd¹.

In het volwassen zoogdierbrein werd het proces van neurogenese waarbij volwassen neuronen worden gemaakt van stam- en voorlopercellen voor het eerst geanalyseerd via labelretentie met thymidine-H^{3 2,3,4} of 5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU)^5,6,7,8 . In deze studies werden proliferatieve cellen gemarkeerd met het thymine-analoog, dat tijdens replicatie en celdeling / proliferatie in het DNA van de cellen werd opgenomen. De gemarkeerde cel, evenals hun nageslacht, bevatte daarom dit analoog, dat vervolgens post-mortem werd geïdentificeerd. Hoewel thymidine-H³ en BrdU het mogelijk maakten om proliferatieve cellen en hun nakomelingen te markeren in hersengebieden waar stamcellen slecht werden begrepen, werden deze studies belemmerd door de nadelen van deze hulpmiddelen. Thymidine-H³ induceert celcyclusstilstand, apoptose en dosisafhankelijke DNA-syntheseremming⁹, terwijl BrdU cellen op verschillende niveaus markeert, afhankelijk van de toedieningsweg¹⁰ en wordt opgenomen door cellen tijdens reparatie of apoptose, evenals tijdens celdeling¹¹. Efficiëntere etiketteringsmethoden zijn onlangs gebruikt, zoals etikettering met 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), maar veel van dezelfde problemen als BrdU blijven nog steeds¹². Deze benaderingen zijn ook beperkend omdat ze elke proliferatieve cel markeren, niet alleen stamcellen, en dus kan de interpretatie van de resultaten worden verward. In de neurogene afstamming behouden alle stam- en voorlopercellen de mitotische capaciteit en alleen terminale / volwassen neuronen zijn niet proliferatief. Voor astrocyten en microglia, maar niet voor oligodendrocyten, wordt de proliferatie voor onbepaalde tijd gehandhaafd 13,14,15.

Transgene muizen die worden gebruikt om alleen cellen te traceren die een eiwit van belang uitdrukken, zoals een eiwit waarvan is bevestigd dat het volwassen stamcellen identificeert zoals we hier gebruiken, zijn daarom gebruikelijker geworden bij het onderzoeken van stamcellen en hun nakomelingen. Hoewel het moeilijk te genereren is via transgene benaderingen van muizen, maken afstammingstracerende muislijnen het mogelijk om specifiek gemarkeerde cellen in de hersenen te traceren en zijn ze niet alleen afhankelijk van proliferatie. In het Tet-On transgene muissysteem induceert toediening van tetracycline of doxycycline (een tetracyclinederivaat) Cre-recombinase-expressie in cellen die zijn ontworpen met een omgekeerde tetracyclinetransactivator (rtTA), die wordt getranscribeerd door een promotor van belang. De Tet-induceerbare Cre-gedreven recombinatie activeert dan de expressie van een onuitwisbaar fluorescerend of luminescerend eiwit in de cellen van belang, afhankelijk van de gebruikte Rosa-reporter muis. Deze onuitwisbaar gemarkeerde cellen blijven deze verslaggever tot expressie brengen na deling, differentiatie of migratie, waardoor deze cellen en hun nakomelingen in de loop van de tijd of na verschillende interventies kunnen worden gevolgd¹⁶. Voordelen van transgene benaderingen voor het traceren van afstamming zijn onder meer: 1) specificiteit van tracering naar een bepaalde cellijn of voorloper/stamcel gemarkeerd door de rtTA, 2) onuitwisbare expressie van het fluorescerende of luminescerende eiwit ondanks celvernieuwing of differentiatie, 3) lage toxiciteit, 4) voorwaardelijke activering tijdens elk punt in de levenscyclus van het dier, en 5) gebruiksgemak met gemeenschappelijke testen, inclusief immunostaining/immunofluorescentie¹⁶.

Andere methoden van tijdelijk induceerbare reportertools bij muizen zijn het gebruik van Cre-ERT2-muizen, die kunnen worden gecombineerd met ROSA-GFP, ROSA-mTmG of andere fluorescerende reportertransgenen. Bij deze dieren drijft een celspecifiek regulerend element, zoals een promotor of enhancer-gebied van belang, de productie van Cre-recombinase aan, dat alleen kan worden geactiveerd via de toediening van tamoxifen. Hoewel Cre-ERT2-muislijnen de inductie van Cre in specifieke cellijnen mogelijk maken, is er een schat aan kennis over de effecten van tamoxifen op volwassen neurogenese^17,18. Bovendien bestaan er veel ROSA-aangedreven fluorescerende reportergenen die kunnen worden gebruikt in plaats van GFP of mTmG, waaronder YFP of CFP, wat alternatieve fluorescerende labeling in andere fluorescerende golflengten mogelijk zou maken. Deze fluorescerende reportergenen kunnen worden gebruikt met Tet-On- of Cre-ERT2-systemen.

Telomerase reverse transcriptase (TERT) is de snelheidsbeperkende component van het holo-enzym telomerase, dat werkt om telomeren uit te breiden nadat ze zijn verkort tijdens celdeling^19,20. TERT is geïdentificeerd als een marker van volwassen weefselstamcellen in de darm^21,22, beenmerg²¹, lever²³,^{vetweefsel 24}, endometrium^25,26 en bot¹. Of TERT-expressie in deze volwassen stamcellen uitsluitend voor telomerase-uitbreidende activiteit is of voor het uitvoeren van niet-canonieke TERT-rollen²⁷ is nog onbekend. TERT-expresserende rustige volwassen stamcellen (qASCs) zijn geïdentificeerd en getraceerd door het hele lichaam met transgene afstamming tracerende muizen om de multipotentie en het zelfvernieuwingsvermogen van deze stamcellen te bestuderen, evenals hun potentieel om te activeren, te vermenigvuldigen, te differentiëren en te migreren 1,22,23,28. De creatie van het Tert-rtTA transgen is eerder uitgevoerd¹. In dit artikel zullen we het gebruik beschrijven van een afstamming die TERT-muislijn traceert om TERT + qASCs te bestuderen die we hebben geïdentificeerd als een nieuwe ASC-populatie in het volwassen muizenbrein.

Generatie van een transgene afstammingslijntraceringsmuislijn
Om een afstammingsspoormuislijn te genereren met behulp van het Tet-On-systeem, moeten drie transgenen worden gecombineerd binnen één dier door middel van muisparing. De eerste is een rtTA, uitgedrukt onder de controle van de promotor van het gen van belang (de onze is TERT-rtTA). In een cel die dit gen van belang tot expressie brengt, zal de rtTA dus tot expressie komen. Het tweede is een oTet-Cre-gen, dat een tetracycline-responselement (TRE) bevat dat de transcriptie van Cre-recombinase mogelijk maakt in aanwezigheid van zowel een rtTA-fusietranscript als tetracycline of doxycycline. Tetracycline of doxycycline kan aan een dier worden toegediend via drinkwater of chow²⁹. Ten slotte moet er een gen zijn dat wordt geactiveerd door Cre-recombinasesplitsing. In dit manuscript is het etiketteringsgen dat we zullen beschrijven het Rosa26-mTmG-gen, dat tot Cre-recombinatie alomtegenwoordig mTomato (membraanrode fluorescentie in alle cellen) zal transcriberen. Als een cel echter het rtTA-transcript tot expressie brengt en tetracycline of doxycycline bevat, zal Cre-recombinatie van een set lox P-sites tussen de mTomato- en mGFP-sites de R26-site veranderen en ervoor zorgen dat de cel membraan-EGFP (mGFP of membraangroene fluorescentie) produceert in plaats van membraantomaat. De onuitwisbare aard van dit mGFP-signaal zal het mogelijk maken om cellen in vivo te labelen en te traceren terwijl ze zich vermenigvuldigen, migreren en differentiëren. Na het spoor kunnen cellen worden geanalyseerd op expressie van GFP via immunofluorescentie in standaard cryosecties of dikkere optisch geklaarde hersenen.

In dit artikel beschrijven we het gebruik van de specifieke muislijn, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. Om deze drievoudige transgene muislijn te creëren, hebben we eerst oTet-Cre-dieren (The Jackson Lab-stam #006234) gekoppeld aan Rosa-mTmG-dieren (The Jackson Lab-stam #007676) om oTet-Cre::Rosa-mTmG dubbele transgene muizen te creëren. Deze dieren werden gegenotypeerd met primers en PCR-sjablonen die zijn aangegeven in de aanvullende tabellen 1 en 2. mTert-rtTA muizen (gemaakt door David Breault¹) werden gepaard met oTet-Cre::Rosa-mTmG dieren om mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG muizen te creëren (Figuur 1A)^1,30. Het werkingsmechanisme van de muislijn mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG wordt geïllustreerd in figuur 1B.

Doxycycline inductie en pulse-chase ontwerp
Bij het plannen van experimenten is het belangrijk om rekening te houden met verschillende factoren die van invloed zijn op de uitkomst van experimenten met het traceren van afstamming, waaronder de leeftijd van het dier bij doxycycline-inductie, de lengte van de toediening van doxycycline (de "puls" -periode), de tijdsduur na verwijdering van doxycycline vóór weefselverzameling (de "chase" -periode) en de timing van eventuele interventies tijdens deze processen. Deze overwegingen voor de onderzoeksopzet zijn essentieel voor het begrijpen van de gelabelde cellen en hun nakomelingen aan het einde van het experiment. De eerste stap in het proces is het identificeren van de leeftijd van interesse van het dier en de lengte van de toediening van doxycycline. Langere pulsperioden zullen het mogelijk maken dat meer cellen de rtTA-gekoppelde promotor tot expressie brengen en dat meer cellen van belang onuitwisbaar worden gemarkeerd. Een celtype dat voorbijgaande expressie van het gen van belang vertoont, kan een langere pulsperiode vereisen dan cellen die continu het gen van belang tot expressie brengen. Als het doel van de studie echter is om kortetermijneffecten van de cel van belang of een acute interventie te begrijpen, kan de pulsperiode niet te lang zijn, omdat zodra een cel is gemarkeerd, deze gedurende de rest van de pulsperiode door een willekeurig aantal veranderingen zal worden getraceerd. In sommige van onze studies werd een 2-daagse puls zonder achtervolgingsperiode gebruikt om een directe verslaggever voor TERT beter na te bootsen. Dit komt omdat de minimale tijdsduur voor recombinatie van het Rosa-mTmG-gen 2 dagen³¹ is.

De volgende essentiële periode in een pulsachtervolgingsexperiment is de lengte tussen verwijdering van doxycycline en perfusie van het dier, ook bekend als de 'achtervolging'. De halfwaardetijd van doxycycline bij muizen is ongeveer 170 minuten, ongeacht de toedieningsweg, waardoor de conclusie mogelijk is dat doxycycline-inductie waarschijnlijk enkele uren na verwijdering niet meer optreedt³². Het is echter belangrijk op te merken dat het doxycyclinemetabolisme langzamer is bij oudere muizen, wat kan leiden tot langere effectieve 'pols'-perioden dan jonge dieren³³.

Tijdens de achtervolgingsperiode zullen gelabelde cellen blijven worden gelabeld, zelfs na proliferatie, differentiatie of migratie. Het nageslacht van deze cellen zal ook worden gelabeld. Het doel van de studie zal de lengte van het pulse-chase paradigma bepalen. Als het doel van de studie is om de regeneratie van een weefsel over een lange periode met de cellen van belang te begrijpen, kan een lange achtervolgingsperiode nodig zijn. Ten slotte moet de timing van eventuele interventies of behandelingen worden bepaald. Toediening tijdens de pulsperiode zal van invloed zijn op de cellen die het gen van belang tot expressie brengen, evenals op elk nageslacht dat in deze periode is gecreëerd, terwijl toediening tijdens de achtervolgingsperiode meestal het nageslacht van de cellen van belang kan beïnvloeden, hoewel dit zal afhangen van hoe snel de gelabelde cellen delen of differentiëren. Voorbeelden van experimentele ontwerpen die we hebben gebruikt, zijn te zien in figuur 2A.

Het is ook belangrijk om op de hoogte te zijn van de mogelijkheid van een GFP-signaal op de achtergrond als gevolg van lekkende expressie. Lekkende expressie treedt op als gevolg van inherente bindingspotentiaal tussen rtTA- en otetsequenties in afwezigheid van doxycycline, en restactiviteit van het otettransgen bij afwezigheid van rtta (herzien in³⁴). Lekkende expressie vertegenwoordigt een zwakte van de Tet-systemen, en hoewel het lek vaak een acceptabel nadeel van het systeem is, kunnen situaties waarin de lekkende expressie kan leiden tot toxiciteit en mortaliteit, zoals bij diptheria-toxine (DTA) bij Otet-DTA-dieren, het gebruik van deze systemen beperken³⁵.

Hersenverwerking, sectie en immunofluorescentie van dunne secties voor microscopie
Om de hersenen van muizen te analyseren na een afstammingstraceringsexperiment, moeten muizen eerst worden doordrenkt via transcardiale perfusie om bloed en liquor te verwijderen die kunnen leiden tot hoge autofluorescentie in de hersenen. Er zijn twee veelgebruikte fixatieven waarmee het dier kan worden doordrenkt: Histochoice Tissue Fixative, een glyoxal fixatief (GF) of 4% paraformaldehyde (PFA). Glyoxal-fixatieven zorgen voor een relatief zacht fixatieproces met minder cross-linking dan PFA. Dit vermindert weefselstijfheid, vermindert de behoefte aan het ophalen van antigeen en zorgt voor minder geconcentreerde antilichaamoplossingen tijdens immunostaining. Als ze echter methanol bevatten, kan dit dienen om de autofluorescentie te verhogen³⁶. Aan de andere kant zal PFA vaak een robuustere fixatie mogelijk maken, en hoewel antigeen ophalen vereist zal zijn tijdens immunostaining, zijn er antilichamen die alleen werken met PFA-gefixeerde weefsels, en perfusie met 4% PFA is vereist voor de optische clearingtechniek die later wordt beschreven.

Het volgen van perfusie is een post-fixatiestap, waarbij de hersenen worden ondergedompeld in hetzelfde type fixatief dat tijdens de perfusie 's nachts wordt gebruikt. Hierdoor kunnen alle hersengebieden die mogelijk niet volledig zijn gefixeerd tijdens de perfusie, blijven fixeren. Vervolgens worden hersenen geïncubeerd in sucrose in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om zoveel mogelijk water te verwijderen vóór de vriesstap om ijsvorming in het weefsel te voorkomen ("cryo-conservering"). Hersenen kunnen dan worden gesneden in een willekeurig aantal sagittale, coronale of transversale weefselsecties voor verwerking. Voor zowel precisie als reproduceerbaarheid moeten gekalibreerde hersenblokken worden gebruikt op een manier die zorgt voor consistente bregma-snijwonden tussen dieren. De belangrijkste factor die van invloed kan zijn op hoe hersenen worden gesegmenteerd, is het hersengebied (en) van belang. Bijvoorbeeld, terwijl een sagittale snede het mogelijk kan maken om meer hersengebieden in één weefselsectie te analyseren, zal deze snede geen analyse van neuro / gliogene gebieden van de ventriculaire-subventriculaire zone (V-SVZ) mogelijk maken, omdat de laterale en mediale zijden van de laterale ventrikel onmogelijk te onderscheiden zijn in die dimensie en beter worden waargenomen in het coronale vlak. Dit kan een belangrijk onderscheid zijn om te maken in neurogenesestudies bij volwassenen, omdat de laterale kant van de laterale ventrikel de neurogene V-SVZ bevat, terwijl de mediale wand van de laterale ventrikel een meer gliogene niche is³⁷.

Nadat weefsels zijn verdeeld in coronale, sagittale of dwarse secties, worden ze in blokken bevroren met behulp van optimal cooling temperature (OCT) inbeddingsoplossing. Hier worden de hersenen ingevroren in dit inbeddingsmateriaal, met behulp van een mengsel van droogijs en ethanol. Als dunne sectieanalyse vereist is, worden blokken op een cryostaat gesneden en afhankelijk van de vereiste downstream-analyse kunnen ze als dunne secties (<20 μm) worden gehecht aan positief geladen glasglaasjes. Glazen dia's die niet zijn opgeladen, kunnen ook worden gebruikt, maar het gebruik van niet-geladen dia's kan ertoe leiden dat weefsels losraken van de dia's³⁸. Als vrij zwevende weefselsecties van gemiddelde dikte (>20 μm) nodig zijn, worden weefsels verzameld als vrij zwevende secties. Als dikke secties (0,5-4 mm) nodig zijn, is het snijden van niet-bevroren hersensecties met een vibratoom vereist. Het is belangrijk om de opslagverschillen op te merken tussen secties op dia's, die moeten worden ingevroren bij -20 tot -80 ° C en vrij zwevende secties, die bij 4 ° C worden opgeslagen.

Hersenzuivering en immunofluorescente confocale microscopie
Als een bredere, maar minder gedetailleerde analyse van de afstammingsgetraceerde cellen in het muizenbrein gewenst is, is een uitgebreide analyse van dikkere segmenten van hersenweefsel mogelijk met iDISCO-hersenreiniging³⁹ gevolgd door immunostaining en betegelde z-stack confocale microscopie of light-sheet microscopie. Hier zullen grote delen van de muizenhersenen optisch worden gewist (een proces van delipidatie³⁹), wat beter fluorescerende signaalbeeldvorming mogelijk maakt over een weefselsectie van 1 mm. De nadelen van dit proces zijn hoge autofluorescentie en een verminderd vermogen om hoge resolutie beelden van celmorfologie en gedetailleerde co-kleuringsanalyse te verkrijgen vanwege de grotere werkafstanden die nodig zijn in vergelijking met meer traditionele methoden (dunne cryosecties of vrij zwevende secties). Om deze reden raden we aan om hersenzuivering te analyseren om de grootschalige afstammingstraceringsresultaten in meerdere hersengebieden te analyseren, in plaats van te proberen individuele cellen te karakteriseren of te analyseren.

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Ohio State University.

1. Creatie van een afstamming die tet-on muislijn, fokstrategieën en genotypering voor experimentele cohortmuizen traceert

OPMERKING: Hier schetsen we de creatie van een Tet-On muissysteem met Rosa-mTmG als het fluorescerende reportergen dat Cre-recombinatie ondergaat, maar verschillende andere Cre-recombinatiegestuurde reporterlijnen kunnen ook worden gebruikt met het Tet-On-systeem.

1. Zet een paringskooi op van één oTet-Cre (+/-) mannetje met één of meerdere R26 (mTmG) (+/+) vrouwtjes. Zie figuur 1 voor een overzicht van de experimentele muisparingsopstelling.
2. Resulterende pups (F1) zijn oTet-Cre (+/-) of oTet-Cre (-/-) en R26 (mTmG) (+/-). Voer genotypering uit volgens de primers in aanvullende tabel 1 en protocollen in aanvullende tabel 2.
3. Voer bij het spenen kiembaantests uit door een oorstoot van elke speen te nemen. Onderzoek de oorpons onder een epifluorescente microscoop in het GFP/FITC-spectrum om te bepalen of het dier in ontwikkeling kiembaanrecombinatie had ondergaan. Als dat zo is, zal het dier GFP in elke cel tot expressie brengen en zal de oorstoot fluoresceren met het mGFP-signaal. Deze dieren kunnen niet worden gebruikt voor paringen of experimenten.
   OPMERKING: Oorclips van muizen die geen kiembaan zijn, tonen alleen endogene fluorescentie onder de microscoop (figuur 1C), terwijl kiembaandieren een helder GFP-signaal vertonen (figuur 1D). Controleoren kunnen afkomstig zijn van muizen die geen fluorescerende transgenen bevatten. Oorharen hebben een hoge endogene fluorescentie en mogen niet als bepalende factor worden gebruikt (figuur 1C). Bovendien worden verschillen in endogene fluorescentie waargenomen tussen muizen met witte versus zwarte vachtkleur, en controles van muizen met dezelfde vachtkleur als muizen die worden getest, moeten in deze analyse worden gebruikt.
4. Paren één mannetje oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/-) met één of meerdere vrouwelijke oTet-Cre (-/-) x R26 (mTmG) muizen.
5. De resulterende generatie (F2) is 1/4 R26 (mTmG) (+/+) en 1/2 Cre (+/-). Kruis deze dieren met mTert-rtTA (+/+) dieren door één oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) te paren met één of meerdere mTert-rtTA (+/+) dieren.
   OPMERKING: We gebruikten mTert-rtTA (+/+) dieren, maar dit proces kan worden uitgevoerd met elke rtTA-muislijn³⁰.
6. Voor proefdieren, stel fokkerijen in om mTert-rtTA (+/+) of (+/-) x oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) of (+/-) te genereren.

2. Doxycycline inductie van Cre en pulse-chase ontwerp

1. Wanneer de dieren de juiste leeftijd hebben om het onderzoek te laten beginnen, vervangt u hun drinkwater door doxwater: drinkwater met 5% sucrose en 2 mg/ml doxycyclinehyclaat. Gebruik Cre-negatieve dieren die dezelfde doxycycline pulse-chase krijgen als proefdieren als een controlegroep voor de resulterende fluorescerende expressiepatronen.
   1. Bewaar na bereiding doxwater bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand. Zie tabel 1 voor meer informatie. Doxwater kan tot 5 dagen aan dieren in drinkflessen worden toegediend voordat het wordt vervangen, omdat schimmelgroei kan optreden als doxwater gedurende langere tijd bij kamertemperatuur wordt achtergelaten.
      OPMERKING: Een doxycyclinepuls van ten minste 2 dagen is vereist voor inductie van mGFP-signaal bij gebruik van het mTmG-transgen (initieel mTmG-papier).
      OPMERKING: We hebben geen andere doxycyclineconcentraties dan 2 mg / ml getest. Eerdere literatuur heeft aangetoond dat deze concentratie de hoogste effecten heeft wanneer deze via drinkwater wordt toegediend²⁹. De hoeveelheid doxycycline die wordt toegediend, kan verschillen afhankelijk van de hoeveelheid drinken door elk dier. Doxycycline-injectie of maagsonde kan ook worden gedaan om consistent te zijn tussen dieren⁴⁰.
2. Nadat de pulsperiode is afgelopen, verwijdert u doxwater uit de kooien en vervangt u het door normaal drinkwater. De dieren zitten nu in de 'achtervolgingsperiode' tot de dood.

3. Transcardiale perfusie en hersendissectie

1. Verwijder een muis uit zijn kooi en houd het dier in bedwang met de linkerduim en wijsvinger. Injecteer het dier via intraperitoneale (i.p.) injectie met een oplossing van 100 mg/ml ketamine en 20 mg/ml xylazine in 0,9% steriele zoutoplossing voor een eindconcentratie van 200 mg/kg ketamine en 20 mg/kg xylazine. Zie tabel 1 voor meer informatie.
   LET OP: De protocollen voor anesthesie kunnen verschillen afhankelijk van het land. Bovendien zijn er effecten van anesthetica op de hersenen, waaronder veranderingen in microgliale morfologie en actie en corticosteronniveaus die moeten worden begrepen bij het uitvoeren van perfusies met het oog op het verzamelen en analyseren van de hersenen^41,42.
2. Na ongeveer 1-2 min verliest het dier zijn rechtzettingsreflex. Om dit te testen, rolt u het dier gewoon op zijn rug en als het niet terug op zijn voeten kan rollen, heeft het de rechtzettingsreflex verloren.
3. Na ongeveer 5-10 minuten verliest het dier zijn pedaalreflex. Om de pedaalreflex te controleren, gebruikt u de duim en wijsvinger om elk van de voeten van het dier te knijpen. Als er geen reactie is, in de vorm van een sprong of spierspasmen, gebruik dan de nagels van de duim en wijsvinger om elk van de voeten van het dier te knijpen. Als er geen reactie is, heeft het dier de pedaalreflex verloren.
   OPMERKING: Als het dier langer dan 15 minuten na de injectie reageert op de pedaalreflex, kan een extra injectie van 1/2 van de initiële ketamine/xylazine-injectie nodig zijn. Leeftijd, geslacht, genotype, fenotype en behandeling kunnen de reactie van het dier op deze medicijncocktail beïnvloeden.
4. Nadat de recht- en pedaalreflexen verloren zijn gegaan, test u de oculaire reflex door licht contact te maken met de muisoogbal met een gehandschoende vinger. Een gebrek aan respons geeft aan dat de oculaire reflex verloren is gegaan.
5. Bevestig de muis in rugligging met poten vastgepind aan een pinnable werkoppervlak.
6. Maak een incisie door de huid met een chirurgische schaar langs de thoracale middellijn ongeveer 1-2 cm onder het xiphoid-proces. Snijd superieur tot bij het xiphoid-proces.
7. Pak het kraakbeen van het xiphoid-proces vast met een tang. Steek een schaar in en knip diagonaal door de spieren en ribbenkast langs de rechterkant van de muis tot ter hoogte van de sleutelbeenderen.
   1. Til de thoracale musculatuur op met een tang en snijd door het middenrif totdat het hart kan worden gevisualiseerd. Maak vervolgens een identieke diagonale snede langs de linkerkant van de muis en zorg ervoor dat contact met het hart wordt voorkomen. Gebruik een hemostat om de thoracale musculatuur uit de buurt van de holte te houden.
      OPMERKING: Op dit moment kan de muis niet meer ademen, dus werk snel om de dood te voorkomen voorafgaand aan de volgende stappen.
8. Zet het kloppende hart vast met een stompe tang en steek een doseernaald in de linker ventrikel door de basis van de aortaboog.
9. Klem de naaldbasis vast aan de linker ventrikel net boven de inbrengplaats.
10. Maak een incisie in het rechter atrium en begin bij het eerste teken van bloedstroom met het perfuseren van het dier met 20 ml 1x PBS bij 8,11 ml / minuut.
11. Nadat de 1x PBS het lichaam heeft doordrenkt, schakelt u over naar het juiste fixatiemiddel voor de downstream-toepassing en perfuseert u de muis met 20 ml fixatief.
    1. Voor bevroren sectie en immunostaining, perfuseer dier met het glyoxale fixatiemiddel voor hersenreiniging, perfuseer dier met 4% PFA in 1x PBS (pH 7,4).
       OPMERKING: Tekenen van een succesvolle perfusie zijn dierlijke stijfheid (lichte stijfheid met glyoxal, intense stijfheid met PFA) en een gebrek aan zichtbare bloedvaten in de weefsels.
12. Onthoofd de muis en verwijder de hersenen door een schaar in de hersenstam in te brengen en langs de squamosale hechting door te snijden naar de frontomaxillaire hechting aan elke kant. Snijd vervolgens over de fontonasale hechting om de schedelkap te verwijderen, waarbij u voorzichtig bent om de olfactorische bol niet te beschadigen. Draai vanaf daar de schedel ondersteboven en gebruik een gebogen tang om de hersenen te verwijderen, waarbij u ervoor zorgt dat de oogzenuw wordt doorgesneden.
13. Plaats de doordrenkte hersenen in een weefselpatroon en dompel het fixatiemiddel onder dat wordt gebruikt om het dier een nacht bij 4 °C te laten doordringen.

4. Behandeling van de hersenen, snijden en immunostaining

1. Hersenbehandeling en snijwonden
   1. Verwijder hersenpatronen uit het glyoxale fixatiemiddel en incubeer in 15% sucrose in 1x PBS gedurende 2 dagen bij 4 °C of totdat de hersenen zinken.
   2. Verwijder hersenpatronen van 15% sucrose en incubeer in 30% sucrose in 1x PBS gedurende 2 dagen bij 4 °C of totdat de hersenen zinken.
      OPMERKING: Zie tabel 1 voor meer informatie.
   3. Verwijder hersenen van 30% sucrose in 1x PBS en scheid de hersenen in verschillende 'blokken' met behulp van een coronaal hersenblok of sagittale hersenblok.
   4. Integreer coronale of sagittale hersensecties in OCT-verbinding door hersensecties op een mengsel van droogijs en ethanol (EtOH) te plaatsen. Nadat OCT wit is geworden en stevig is geworden, verwijdert u het droogijs-EtOH-mengsel en bewaart u het in parafilm gewikkeld in een luchtdichte zak bij -20 °C.
   5. Haal bevroren blokken uit de vriezer en plaats in een cryostaat met een inwendige temperatuur ingesteld op -20 °C. Gebruik OCT om het blok aan een metalen klauwplaat te bevestigen, zodat het weefsel stevig is bevestigd. Wacht ~ 5 minuten voordat het weefsel bevriest tot de klauwplaat. Snijd het weefsel op 7 μm en plaats elk plakje weefsel op een geladen glazen dia.
   6. Laat dia's een nacht bakken bij 37 °C en plaats ze vervolgens bij -20 °C totdat ze worden gebruikt voor immunostaining.
2. Immunostaining
   1. Warm glijden tot kamertemperatuur (RT) en post-fix met ijskoude aceton gedurende 15 min.
   2. Wasglaasjes gedurende 5 minuten in 1x spoelbuffer (bijv. IHC Select TBS Rinse Buffer), schudden bij 60 rpm bij RT tussen elke stap.
   3. Permeabilize voor kleuring van nucleaire antigenen met 0,3% Triton X-100 gedurende 10 minuten bij RT. Permeabilize voor kleuring van cytoplasmatische antigenen met 0,3% Tween-20 gedurende 10 minuten bij RT.
   4. Voer antigeen ophalen uit door dia's in de magnetron te doen in 50-100 ml 1x DAKO Antigen Retrieval Solution op laag gedurende 10 minuten, tweemaal. Spoel vervolgens met spoelbuffer gedurende 5 minuten op RT.
   5. Incubeer dia's in 0,3% Typogen Black in 70% EtOH gedurende 20 minuten op RT en was vervolgens met spoelbuffer.
   6. Teken een hydrofobe barrière rond elk weefsel zonder weefsels te laten drogen. Blok vervolgens gedurende 20 minuten bij 37 °C met 1 druppel Millipore Blocking Reagens per weefsel. Voeg vervolgens 100 μL primair antilichaam verdund in antilichaamverdunningsmiddel toe aan elk weefsel en incubeer 's nachts bij 4 °C.
   7. De volgende dag incubeer secties in Alexa Fluor secundaire antilichamen gedurende 10 minuten bij RT. Was vervolgens glaasjes in spoelbuffer.
   8. Bedek hersensecties in 100 μL van 1:500 anti-GFP-antilichaam geconjugeerd met AlexaFluor 488 om de endogene GFP-signaalmarkering getraceerde cellen te stimuleren en 's nachts bij 4 °C te incuberen.
   9. Was de volgende dag 2x met spoelbuffer en was vervolgens 5 minuten in stromend DI-water.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u voorzichtig wast met DI-water en zorg ervoor dat u geen stromend water op dia's zelf vermijdt die hersensecties van dia's kunnen verwijderen.
   10. Counterstain met 100 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) gedurende 5 min. Was vervolgens 5 min in stromend DI-water.
   11. Voeg een druppel montagemedium toe op elke weefselsectie en sluit af met een afdeklip van 22 mm x 22 mm. Beeldvorming wordt aanbevolen op de dag van montage om een optimaal signaal te garanderen.

5. iDISCO hersenreiniging (aangepast van³⁹)

1. Fixatie en secties
   1. Post-fix hersenen in 4% PFA 's nachts bij 4 °C en dan opnieuw gedurende 1 uur bij RT.
   2. Was de hersenen in 1x PBS gedurende een uur, twee keer, bij RT. Snijd vervolgens in 1 mm dikke secties met behulp van het benodigde hersenblok en plaats in 5 ml microcentrifugebuizen met 1x PBS.
2. Methanol voorbehandeling (met methanol)
   OPMERKING: Vanwege de mogelijkheid dat methanol de immunostaining van bepaalde eiwitten beïnvloedt, willen de auteurs de lezer wijzen op Renier et al. 2014 voor een protocol bij een methanolvrij iDISCO-protocolalternatief³⁹. Zie tabel 1 voor meer informatie over de volgende oplossingen in deze sectie.
   1. Tweemaal 1x PBS wassen met 1x PBS (schudden) op RT.
   2. Was in 50% methanol (in PBS) gedurende 1 uur (schudden) op RT.
   3. Was in 80% methanol gedurende 1 uur (schudden) op RT.
   4. Was tweemaal 1 uur in 100% methanol (schudden) op RT.
   5. Bleekmonsters met 5% waterstofperoxide (H₂O₂) in 20% dimethylsulfoxide (DMSO)/methanol (1 volume 30% H₂O₂/1 volume DMSO/4 volume methanol, ijskoud) bij 4 °C 's nachts (schudden).
   6. Was na het bleken monsters tweemaal 1 uur in methanol (schudden) op RT.
   7. Was tweemaal 20% DMSO/methanol in 1 uur (schudden) bij RT.
   8. Was in 80% methanol gedurende 1 uur (schudden) op RT.
   9. Was in 50% methanol gedurende 1 uur (schudden) op RT.
   10. Tweemaal 1 uur in PBS wassen (schudden) bij RT.
   11. Was tweemaal 1 uur in PBS/0,2% Triton X-100 (schudden) bij RT.
3. Immunostaining van het opruimen van hersenen
   1. Incubeer monsters in 1x PBS/0,2% Triton X-100/20% DMSO/0,3 M glycine bij 37 °C 's nachts op een orbitale shaker.
   2. Blok in 1x PBS/0,2% Triton X-100/10% DMSO/6% geitenserum bij 37 °C gedurende 3 dagen op een orbitale shaker.
   3. Was monsters in 1x PBS/0,2% Tween-20/10 μg/ml heparinenatriumzout uit varkensslijmvlies gedurende 1 uur tweemaal bij 37 °C, en incubeer vervolgens in 1x PBS/0,2% Tween-20/10 μg/ml heparine/5% DMSO/3% geitenserum met 1:500 concentratie konijn anti-GFP AlexaFluor 488 bij 37 °C op een orbitale shaker gedurende 2 dagen.
   4. Was monsters in 1x PBS/0,2% Tween-20 met 10 μg/ml heparine gedurende 1 uur bij 37 °C op orbitale shaker, drie keer, en dan eenmaal daags gedurende 2 dagen.
   5. Incubeer monsters 's nachts in 10 ml van 50% v / v tetrahydrofuraan (THF) / H₂O in een conische buis van 15 ml.
   6. Incubeer monsters gedurende 1 uur in 10 ml van 80% THF / H₂O.
   7. Incubeer monsters tweemaal gedurende 1 uur in 100% THF.
   8. Droog monsters met een steriel doekje en incubeer in dichloormethaan totdat ze naar de bodem van de injectieflacon zinken (ongeveer 40 min). Niet incuberen >60 min.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u dichloormethaan onder een zuurkast verwerkt.
   9. Incubeer monsters in 18 ml dibenzylether (DBE) tot ze helder zijn (>2 uur).
   10. Bewaar voorbeelden in DBE bij RT totdat ze klaar zijn voor de afbeelding.
       OPMERKING: Voor de beste resultaten is het belangrijk om voorbeelden zo snel mogelijk te bekijken nadat het wissen is voltooid.

6. Beeldvorming van gekleurde dia's of gewiste hersenen

1. Om immunostained hersensecties in beeld te brengen, analyseert u dia's via confocale microscopie, waar co-expressie van meerdere antilichamen kan worden bevestigd. We gebruiken een Leica Stellaris 5 microscoop met HyD S hybride detectoren, maar elke point scanning confocale microscoop zal werken. De doelstellingen omvatten HC PL APO 10x/0.40 CS2, HC PL APO 40x/1.30 OIL CS2 en HC PL APO 63x/1.40.
   1. Configureer de juiste laserlijnen en emissiefilters. De vereiste lasers en bijbehorende laserintensiteiten zijn afhankelijk van de microscoop- en fluorofoorcombinaties die worden gebruikt.
      OPMERKING: We gebruiken een combinatie van diode 405 nm en witlichtlasers om excitatie- en emissiespectra voor elke fluorofoor of groepen fluoroforen af te stemmen die worden gebruikt om overspraak te verminderen en te elimineren. Vergelijkbare resultaten kunnen ook worden bereikt met behulp van traditionele laser / filtercombinaties, maar let goed op het doorbloeden van kanalen. Doorbloeding kan worden geïdentificeerd door een enkele laserlijn in te schakelen in combinatie met elk van de gewenste emissiefiltercombinaties om te zien welke kanalen worden beïnvloed door elke specifieke laser. Als de diode 405 nm-laser bijvoorbeeld zichtbare fluorescentie produceert in het GFP-emissiefilter, treedt er bloeding op. Zorg ervoor dat meerdere kanalen sequentieel frame voor frame worden afgebeeld om eventuele doorbloedingen aanzienlijk te verminderen.
   2. Voor co-gekleurde Tet-On-hersenen met een mTmG-reporter selecteert u DAPI (ex. 405 nm, em. 450 nm), GFP (ex. 488 nm, em. 509 nm), tdTomato (ex. 555 nm, em. 582 nm) en de overeenkomstige verrode fluorofoor om overeen te komen met de fluorofoor die op het secundaire antilichaam wordt gebruikt. We raden Alexa Fluor 647 aan (bijv. 651 nm, em. 667 nm).
   3. Stel eerst instellingen vast met een Cre-controlebrein gekleurd met zowel GFP als de fluorescerende secundaire. Deze hersenplakken controleren op achtergrondfluorescentie van de fluorescerende antilichamen en vertonen geen echt GFP-signaal.
   4. Analyseer elk hersengedeelte van boven naar beneden, van links naar rechts, om te controleren of er geen signaal is gemist in de analyse. Als u hetzelfde hersengedeelte bij verschillende vergrotingen in beeld brengt, wordt aanbevolen dat eerst de lagere vergrotingen worden gebruikt, omdat de hogere vergroting het mTomato-signaal sneller zal bleken.
2. Om gewiste hersenen in beeld te brengen, gebruikt u een omgekeerde confocale microscoop met een geautomatiseerd stadium en een geautomatiseerde tegelfunctie. We gebruiken de Leica Stellaris 5 microscoop. Omdat de monsters zo dik zijn (>500 μm), zijn grotere werkafstanden nodig die de vergroting beperken die effectief kan worden bereikt. We gebruiken de HC PL APO 10x/0.40 CS2 objectieve voor alle cleared brain imaging.
   1. Begin met het plat leggen van een opgeruimd hersengedeelte tegen een glazen bodemschaal en dompel onder in dibenzylether.
      OPMERKING: Dibenzyllether is corrosief voor de meeste objectieve lenzen en de meeste kunststoffen. Om deze reden moet elk binnenplastic in de glazen bodemschaal worden gecoat met sneldrogend siliconenelastomeer.
   2. Configureer de juiste laserlijnen en emissiefilters. Voor co-gekleurde Tet-On-hersenen met een mTmG-verslaggever selecteert u DAPI, GFP, tdTomato en de bijbehorende verrode fluorofoor om overeen te komen met de fluorofoor die op het secundaire antilichaam wordt gebruikt. Stel de gewenste resolutie in, we raden ten minste 1024 x 1024 aan. Stel pinhole in op 1 AU.
   3. Bepaal eerst de laserintensiteit en detectorversterking met een Cre-control brein gekleurd met zowel GFP als de fluorescerende secundaire. Deze hersenplakken controleren op achtergrondfluorescentie van de fluorescerende antilichamen en vertonen geen echt GFP-signaal.
   4. Zodra laserintensiteiten en detectorversterking zijn geoptimaliseerd, brengt u de hersenen in kaart voor beeldvorming. Begin met het lokaliseren van de volledige omtrek van het hersengedeelte om de X- en Y-as van de beeldacquisitie in te stellen. Identificeer vervolgens de Z-as door het brandpunt in te stellen op ongeveer de middelste diepte van het weefsel en gebruik Z-positioneringsregelaars om het "hoogste" punt van het weefsel te lokaliseren (meest positieve Z-waarde). Scan verschillende delen van het weefsel en verhoog de maximale Z-ashoogte indien nodig.
      1. Herhaal dit voor het "laagste" (meest negatieve Z-waarde) punt dat nodig is om de volledige dikte van het weefsel te verkrijgen. De Stellaris 5 heeft een limiet van ± 250 um van het brandpunt. Dit beperkt optische secties tot 500 μm dik in de Z-as. Het 3D-gebied van het hersengedeelte is nu bekend.
   5. Stel de Z-step grootte in op 6 μm en begin met het verkrijgen van de afbeelding. De acquisitietijd is afhankelijk van verschillende factoren en kan variëren van uren tot dagen, afhankelijk van de gewenste parameters. Als u de tijd voor het verkrijgen van afbeeldingen wilt verkorten, probeert u de resoluties te verlagen, de laserscansnelheid te verhogen of de stapgrootte te vergroten.
   6. Zodra het betegelde beeld van het hele vrijgemaakte hersengedeelte is vastgelegd, analyseert u naar wens.

Hoewel het fluorescerende signaal dat het gevolg is van een Tet-On-systeem met een fluorescerende reporter zal variëren afhankelijk van de promotor van interesse en de gebruikte fluorofoor (en), zullen we beschrijven hoe bevindingen werden geanalyseerd met mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-dieren. Analyse van volwassen hersenen na een pulsachtervolging resulteerde in membraan GFP-expresserende cellen in verschillende anatomische niches. Het verschil in fluorescerende intensiteit tussen verschillende celtypen moet worden opgemerkt. Een variabele met betrekking tot fluorescerende intensiteit is de grootte van het celmembraan. Zo hebben vaatoïde epitheelcellen (CPEC's) in de plexus choroid plexus een dik celmembraan en een sterk fluorescerend signaal dat gemakkelijk te onderscheiden was van de omliggende cellen (figuur 4A,B). Andere kleinere en momenteel niet-geïdentificeerde celtypen in het plexus plexus stroma hadden echter een zwakker GFP-signaal (figuur 4C). In het cerebellum brachten Bergmann-gliacellen hogere niveaus van mGFP tot expressie dan mandcellen, en variatie in mGFP-expressie bestond zelfs tussen individuele mandcellen (figuur 4D). Olfactorische sensorische neuron axonen in de glomerulaire laag van de olfactorische bol drukten ook hoge niveaus van mGFP uit (figuur 4A, E). Om ervoor te zorgen dat alle mGFP+ cellen worden geïdentificeerd, is het daarom belangrijk om zowel heldere als zwakke GFP+ cellen in de hersenen van mTmG-dieren te identificeren. Bij mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-dieren zagen we lage mGFP-expressie op de achtergrond in hersengebieden, waaronder de hersenschors (figuur 4A). Interessant is dat het cerebellum en de hersenstam op deze manier een lagere mGFP-expressie op de achtergrond vertoonden (figuur 4A).

Tijdens de analyse van hersenweefsel na een afstammingsspoor zullen er verschillen zijn in mGFP- en mTomato-expressiepatronen tussen zowel hersengebieden als celtypen. Olfactorische sensorische neuron axonen die de glomerulaire laag van de olfactorische bol vullen, drukten hoge niveaus van membraantomaat uit in vergelijking met de meeste andere hersengebieden, zelfs wanneer dezelfde neuronen mGFP + zijn, wat aangeeft dat sommige cellen het mTomato-signaal langzamer leken te verliezen (figuur 4D). In de plexus van het vaatvlies daarentegen brachten mGFP+-cellen een lage mTomato tot expressie (figuur 4B,C). In de meeste andere hersengebieden is het tomatensignaal gelijkmatig verdeeld over celtypen, waarbij endotheelcellen enkele van de enige cellen zijn waarvan het fluorescerende signaal helder genoeg was om op te vallen tegen de rode fluorescerende achtergrond (figuur 4B). De activering van mGFP-expressie en splitsing van mTomato uit het genoom tijdens recombinatie resulteert in een verlies van mTomato-expressie, maar de mTomato-fluoroforen die op het membraan tot expressie komen, blijven behouden totdat ze afbreken. Om deze reden zullen mGFP + -cellen vaak een variabel mTomato-signaal tot expressie brengen, dat afhankelijk is van de recentheid van de recombinatie, het celtype en de grootte van het celmembraan. Daarom is het belangrijk om cellen te analyseren op basis van de expressie van mGFP en ze niet uit te sluiten van analyse als ze zowel mGFP als mTomato tot expressie brengen.

Alternatieve verslaggevers kunnen ook worden gebruikt in combinatie met het Tet-On-systeem. Cre-recombinatie kan werken om expressie van GFP of RFP in cellen te induceren die normaal gesproken geen fluorescerende tag tot expressie brengen bij Rosa-GFP- of Rosa-RFP-dieren. Hier zal analyse van GFP of RFP de uitdrukking van de promotor van belang aangeven en zal er geen fluorofoorsignaal worden verwijderd zoals bij mTmG-dieren. Single-fluorofoor reporters zorgen voor immunostaining met meer fluorescerende antilichaamcombinaties, omdat de membraantomaat bij mTmG-dieren kleuring in de rode golflengte voorkomt.

Figuur 1. Generatie van een Tet-On muislijn. (A) Overzicht van het fokschema voor het maken van mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG muizen uit individuele muislijnen. (B) Schema van het Tet-On systeem in de mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG muislijn. (C-D) Representatieve beelden van oorclips afgebeeld met FITC-kanaal van een epifluorescente microscoop van niet-kiembaan (C) en kiembaan (D) mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG muizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Experimentele ontwerpen met afstamming tracering Tet-On muizen. Illustraties van experimenten mogelijk met Tet-On muizen van basale proliferatie, migratie en differentiatie (1) tot behandelingen tijdens doxpuls zonder jacht op regeneratie of re-equilibratie (2), interventies tijdens pulse met een mogelijkheid om langetermijneffecten te visualiseren (3). Een korte puls van 2 dagen zonder daaropvolgende achtervolging zal inzicht geven in een bijna-basale toestand van TERT + -cellen, omdat deze cellen weinig tijd hebben om te activeren, te vermenigvuldigen, te migreren of te differentiëren (4). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Hersenzuivering van mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG muizenhersenen. (A) Sagittale sectie van 1 mm hersensecties na fixatie. (B) Individuele hersensecties worden in 5 ml-buizen geplaatst voor iDISCO-hersenreiniging³⁹. (C) Vrijgemaakte hersenen worden in glazen bodemschotels geplaatst en ondergedompeld in DBE voor refractieve indexmatching tijdens beeldacquisitie. (D) Leg het hele gebied van de hersenen vast als een reeks Z-stacks die samen worden betegeld om één uitgebreid 3D-beeld van de hersenen te vormen. Dit kan vervolgens Z-maximale intensiteit zijn die wordt geprojecteerd om een 2D-afbeelding te maken van de 3D-dataset. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Lineage tracing van volwassen mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG muizenhersenen na een puls van 3 weken en 11 dagen achtervolging van doxycycline. (A) Gewist hersengedeelte van volwassen mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG muis met specifieke gebieden van mGFP-signaal weergegeven met inzetstukken (N = 3 mannelijke muizen). (B-C) Representatief beeld van mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG choroid plexus die mGFP+ CPEC's (B) en kleinere, zwakkere mGFP+ celtypen (C; N = 4 mannetjes, N = 6 vrouwtjes). (D) Representatief beeld van mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG cerebellaire Bergmann glia (helder) en mandcellen in de moleculaire laag van het cerebellum (dim; N = 4 mannetjes, N = 6 vrouwtjes). (E) Representatief beeld van de olfactorische glomerulaire laag van mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG hersenen. Stippellijnen geven glomerulaire compartimenten aan (N = 4 mannetjes, N = 6 vrouwtjes). Schaalbalken zijn 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 1. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 2. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Een methode voor het creëren, gebruiken en analyseren van een triple transgene afstamming traceert muizenlijn die stamcellen markeert in het volwassen muizenbrein in vivo wordt beschreven. In combinatie met immunostaining of hersenreiniging kan de identificatie en karakterisering van getraceerde fluorescerende cellen in de hersenen worden bereikt. Deze techniek biedt de mogelijkheid om het plastische / regeneratieve / remodelleringspotentieel van gelabelde stamcellen te begrijpen terwijl ze activeren, migreren, differentiëren of prolifereren. Terwijl eerdere gegevens verkregen via labelretentie met thymidine-H³ en BrdU concludeerden dat de V-SVZ, reukbol en subgranulaire zone van de gyrus dentate de enige neurogene hersengebieden waren bij volwassen zoogdieren 2,3,4,5,6,7,8,43, is het nu duidelijk dat volwassen neurogenese ook voorkomt in de cortex⁴⁴, hypothalamus^45,46 en striatum 47,48,49, evenals mogelijk andere nieuwe niches die niet goed zijn bestudeerd. Volwassen gliogenese, het proces waarbij gliavoorlopercellen pasgeboren astrocyten en oligodendrocyten creëren, komt ook in de hersenen voor³⁷, en glia en neuronen worden verondersteld afgeleid te zijn van dezelfde multipotente stamcel. Om deze redenen zijn afstammingstraceringsstudies een integraal onderdeel geweest van het begrijpen van de rol van verschillende stamceltypen die bijdragen aan het aanvullen en regenereren van neuronen en glia in het volwassen zoogdierbrein (besproken in⁵⁰).

Voor studies in plasticiteit van de hersenen van volwassenen is de optimale leeftijd 12 weken oud, wanneer het muizenbrein de ontwikkeling^{heeft voltooid 51}. Bij het plannen van de lengte van de doxycyclinepuls en de daaropvolgende achtervolging, is een goed begrip van het interesseproces cruciaal, zodat de timing van de pulsachtervolging lang genoeg is om de processen van belang te laten plaatsvinden. Bijvoorbeeld, de creatie van pasgeboren neuronen in de olfactorische bol uit volwassen neurale stamcellen (ANSC's) in de V-SVZ is ongeveer 4 weken, zoals bepaald door eerdere lineage tracing studies⁵². Een pulse-chase studie die de ANSC's in de V-SVZ zal labelen, moet daarom binnen dat tijdsbestek zijn om de ANSC's in de V-SVZ te laten delen, voor deze ANSC's om te differentiëren in intermediaire celtypen, en voor deze intermediaire celtypen om te migreren naar de olfactorische bol en te differentiëren in volwassen neuronen. De lengte van de achtervolging zal bepalen hoe lang gelabelde cellen en hun nakomelingen hun migratie en differentiatie moeten voortzetten, hoewel deze processen ook tijdens de pols zullen plaatsvinden. Alles bij elkaar genomen is het belangrijk om de betrokken processen te begrijpen, omdat de tijdlijn van elk afstammingstraceringsexperiment de juiste processen mogelijk moet maken.

Hoewel dit manuscript het Tet-On-systeem beschrijft, bestaan er andere afstammingstransgenen die kunnen worden gebruikt. Het CreER^T2-transgen zorgt voor de expressie van een Cre-recombinase dat alleen actief is in aanwezigheid van tamoxifen of 4-OHT, een tamoxifenderivaat. Wanneer deze Cre wordt gereguleerd door een promotor van belang, zal 4-OHT of tamoxifen toediening alleen Cre-recombinatie produceren in cellen die die promotor tot expressie brengen. In combinatie met een reporter-gen zoals Rosa-LSL-GFP of Rosa-mTmG, zal Cre-lox-recombinatie onuitwisbaar de cellen markeren die Cre tot expressie brengen tijdens de toediening van tamoxifen. Een nadeel van dit systeem is het gebruik van tamoxifen, dat langdurige bijwerkingen heeft op neurogenese in zowel prenatale als volwassen hersenen¹⁷. Om deze reden zullen afstammingstraceringsstudies met CreER^T2-lijnen rekening moeten houden met de betrokken kanttekeningen.

Afstammingstraceringsstudies in de volwassen hersenen worden vaak uitgevoerd met markers van stamcellen zoals Nestin of markers van gliavoorlopercellen, waaronder NG2^53,54. Hoewel de resulterende gegevens de omzet en differentiatie van deze cellen in pasgeboren volwassen celtypen aangeven, kan de expressie van deze markers door verschillende andere celtypen in de volwassen hersenen verwarrend zijn. Nestin, een intermediair filamenteiwit dat betrokken is bij mitose⁵⁵, wordt bijvoorbeeld ook uitgedrukt door volwassen neuronen⁵⁶ en meningeale celtypen⁵⁷. Andere stamcelmarkers zijn glial fibrillary acidic protein (GFAP)^58,59 en glutamaat aspartaat transporter 1 (GLAST)⁶⁰, die ook door astrocyten in de volwassen hersenen tot expressie worden gebracht⁶¹. Om deze reden zijn afstammingstraceringsstudies met aanvullende markers nodig. Naarmate we meer te weten komen over de brede impact van plasticiteit van volwassenen in de hersenen, blijven de karakterisering en analyse van de cellen die een rol spelen in deze processen en hun nakomelingen van vitaal belang voor ons begrip van neurogene en gliogene paden die betrokken zijn bij neurodegeneratieve gezondheid en meer.