वयस्क माउस मस्तिष्क में प्रेरक फ्लोरोसेंटली-लेबल स्टेम सेल की वंशावली अनुरेखण
Summary
एक प्रेरक ट्रांसजेनिक वंश अनुरेखण माउस लाइन का उपयोग करके फ्लोरोफोर के साथ स्टेम कोशिकाओं और उनकी संतानों को स्थायी रूप से चिह्नित करने की क्षमता विवो में सक्रियण, प्रसार, प्रवास और / या भेदभाव के स्थानिक और अस्थायी विश्लेषण की अनुमति देती है। वंश अनुरेखण वंश प्रतिबद्धता, हस्तक्षेप (ओं) की प्रतिक्रिया और मल्टीपोटेंसी के बारे में उपन्यास जानकारी प्रकट कर सकता है।
Abstract
टर्ट प्रमोटर से जुड़े एक उपन्यास रिवर्स टेट्रासाइक्लिन ट्रांसएक्टिवेटर (आरटीटीए) ट्रांसजीन के साथ ‘टेट-ऑन’ सिस्टम ओटेट-क्रे माउस को पार करके वयस्क ऊतक स्टेम कोशिकाओं के व्यवहार और भाग्य की जांच करने के लिए एक टेलोमेरेज़ रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (टर्ट) वंश-अनुरेखण माउस लाइन विकसित की गई थी, जिसे हमने वयस्क मस्तिष्क स्टेम कोशिकाओं की एक उपन्यास आबादी के निशान का प्रदर्शन किया है। यहां, टेट्रासाइक्लिन व्युत्पन्न डॉक्सीसाइक्लिन का प्रशासन एमटीईआरटी-आरटीटीए :: ओटेट-क्रे चूहों को अमिट रूप से कोशिकाओं की आबादी को चिह्नित करेगा जो जीन टर्ट के प्रमोटर क्षेत्र के 4.4 केबी टुकड़े को व्यक्त करते हैं। जब रोजा-एमटीएमजी रिपोर्टर को जोड़ा जाता है, तो एमटीर्ट-आरटीटीए :: ओटेट-क्रे :: रोजा-एमटीएमजी चूहे झिल्ली टीडीटोमैटो (एमटोमैटो) व्यक्त करेंगे जब तक कि डॉक्सीसाइक्लिन उपचार कोशिकाओं में झिल्ली ईजीएफपी (एमजीएफपी) के साथ एमटीमैटो अभिव्यक्ति के प्रतिस्थापन को प्रेरित नहीं करता है जो टर्ट को भी व्यक्त करते हैं। इसलिए, जब इन ट्रिपल-ट्रांसजेनिक वंश अनुरेखण चूहों को डॉक्सीसाइक्लिन (“पल्स” अवधि जिसके दौरान टीईआरटी व्यक्त कोशिकाओं को चिह्नित किया जाता है) प्राप्त होता है, तो ये कोशिकाएं अमिट रूप से चिह्नित एमजीएफपी + कोशिकाएं बन जाएंगी, जिन्हें डॉक्सीसाइक्लिन हटाने (“पीछा” अवधि) के बाद किसी भी वांछनीय समय के लिए ट्रैक किया जा सकता है, भले ही टर्ट अभिव्यक्ति बाद में खो गई हो। मस्तिष्क को तब छिड़काव-तय किया जाता है और इम्यूनोफ्लोरेसेंस और अन्य डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए संसाधित किया जाता है ताकि स्टेम सेल सक्रियण, प्रसार, वंश प्रतिबद्धता, विभिन्न मस्तिष्क निचे में प्रवास, और परिपक्व सेल प्रकारों के लिए भेदभाव में परिवर्तन की व्याख्या की जा सके। इस प्रणाली का उपयोग करके, स्टेम कोशिकाओं के मार्करों का उपयोग करके डॉक्सीसाइक्लिन-प्रेरक “पल्स-चेस” वंश अनुरेखण प्रयोगों का संचालन करने के लिए किसी भी आरटीटीए माउस को ओटेट-क्रे और रोजा रिपोर्टर से जोड़ा जा सकता है।
Introduction
वंश अनुरेखण माउस लाइन का मान
विवो में स्टेम कोशिकाओं का विश्लेषण मुश्किल हो सकता है क्योंकि कई परख जो ऐसी कोशिकाओं की जांच करते हैं, केवल जानवर की मृत्यु के समय इन कोशिकाओं को चिह्नित करने पर ध्यान केंद्रित करते हैं, जो समय में टर्मिनल स्नैपशॉट का प्रतिनिधित्व करता है। समय के साथ पूर्वज, मध्यवर्ती / संक्रमण कोशिका प्रकार, और परिपक्व कोशिकाओं के प्रसार, भेदभाव और प्रवास की प्रक्रियाओं को बेहतर ढंग से समझने के लिए, एक अनुदैर्ध्य विश्लेषण दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। यह वंश अनुरेखण अध्ययनों के साथ प्राप्त किया जा सकता है जिससे स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं को अमिट रूप से चिह्नित किया जाता है और बाद में किसी भी समय के लिए पालन किया जा सकता है1.
वयस्क स्तनधारी मस्तिष्क में, न्यूरोजेनेसिस की प्रक्रिया जिसके द्वारा वयस्क जन्मे न्यूरॉन्स स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं से बनाए जाते हैं, का विश्लेषण पहली बार थाइमिडीन-एच 3 2,3,4 या 5-ब्रोमो -2′-डीऑक्सीयूरिडीन (बीआरडीयू) 5,6,7,8 के साथ लेबल प्रतिधारण के माध्यम से किया गया था . इन अध्ययनों में, प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं को थाइमिन एनालॉग के साथ चिह्नित किया गया था, जिसे प्रतिकृति और कोशिका विभाजन / प्रसार के दौरान कोशिकाओं के डीएनए में शामिल किया गया था। चिह्नित सेल, साथ ही साथ उनकी संतान, इसलिए इस एनालॉग को निहित करती थी, जिसे तब पोस्टमार्टम की पहचान की गई थी। हालांकि, जबकि थाइमिडीन-एच3 और बीआरडीयू ने मस्तिष्क क्षेत्रों में प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं और उनकी संतानों के अंकन की अनुमति दी, जहां स्टेम कोशिकाओं को खराब समझा गया था, इन अध्ययनों को इन उपकरणों के डाउनसाइड्स द्वारा बाधित किया गया था। थाइमिडीन-एच3 कोशिका-चक्र गिरफ्तारी, एपोप्टोसिस और खुराक-निर्भर डीएनए संश्लेषण निषेध9 को प्रेरित करता है, जबकि बीआरडीयू प्रशासन 10 के मार्ग के आधार पर अलग-अलगस्तरों पर कोशिकाओं को चिह्नित करता है और मरम्मत या एपोप्टोसिस के दौरान कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है, साथ ही साथ कोशिका विभाजन11 के दौरान भी। हाल ही में अधिक कुशल लेबलिंग विधियों का उपयोग किया गया है, जैसे कि 5-एथिनाइल -2′-डीऑक्सीयूरिडीन (ईडीयू) के साथ लेबलिंग, लेकिन बीआरडीयू के समान कई मुद्दे अभी भी12 बने हुए हैं। ये दृष्टिकोण भी सीमित हैं कि वे किसी भी प्रोलिफेरेटिव सेल को चिह्नित करते हैं, न केवल स्टेम सेल, और इस प्रकार परिणामों की व्याख्या को भ्रमित किया जा सकता है। न्यूरोजेनिक वंश में, सभी स्टेम और पूर्वज कोशिकाएं माइटोटिक क्षमता को बनाए रखती हैं, और केवल टर्मिनल / एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया के लिए, लेकिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स नहीं, प्रसार अनिश्चित काल तक 13,14,15 बनाए रखा जाता है।
ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग केवल उन कोशिकाओं का पता लगाने के लिए किया जाता है जो ब्याज के प्रोटीन को व्यक्त करते हैं, जैसे कि वयस्क स्टेम कोशिकाओं की पहचान करने की पुष्टि की जाती है जैसा कि हम यहां उपयोग करते हैं, इसलिए स्टेम कोशिकाओं और उनकी संतानों की जांच करते समय अधिक आम हो गए हैं। जबकि माउस ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण के माध्यम से उत्पन्न करना मुश्किल है, वंश-अनुरेखण माउस लाइनें मस्तिष्क में विशेष रूप से चिह्नित कोशिकाओं के अनुरेखण की अनुमति देती हैं, और अकेले प्रसार पर भरोसा नहीं करती हैं। टेट-ऑन ट्रांसजेनिक माउस सिस्टम में, टेट्रासाइक्लिन या डॉक्सीसाइक्लिन (एक टेट्रासाइक्लिन व्युत्पन्न) का प्रशासन कोशिकाओं में क्रे-रीकॉम्बिनेज अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है जिन्हें रिवर्स टेट्रासाइक्लिन ट्रांसएक्टिवेटर (आरटीटीए) के साथ इंजीनियर किया गया है, जिसे ब्याज के प्रमोटर द्वारा स्थानांतरित किया गया है। टेट-इंड्यूसिबल क्रे-संचालित पुनर्संयोजन तब ब्याज की कोशिकाओं में एक अमिट फ्लोरोसेंट या ल्यूमिनेसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति को सक्रिय करेगा, जो रोजा-रिपोर्टर माउस पर निर्भर करता है। ये अमिट रूप से चिह्नित कोशिकाएं विभाजन, भेदभाव या प्रवास के बाद इस रिपोर्टर को व्यक्त करना जारी रखती हैं, जिससे समय के साथ या विभिन्न हस्तक्षेपों के बाद इन कोशिकाओं और उनकी संतानों की ट्रैकिंग की अनुमति मिलतीहै 16. ट्रांसजेनिक वंश-अनुरेखण दृष्टिकोणों के फायदों में शामिल हैं: 1) आरटीटीए द्वारा चिह्नित एक विशेष सेल वंश या पूर्वज / स्टेम सेल के अनुरेखण की विशिष्टता, 2) सेल टर्नओवर या भेदभाव के बावजूद फ्लोरोसेंट या ल्यूमिनेसेंट प्रोटीन की अमिट अभिव्यक्ति, 3) कम विषाक्तता, 4) जानवर के जीवन चक्र में किसी भी बिंदु के दौरान सशर्त सक्रियण, और 5) सामान्य परख के साथ उपयोग में आसानी, इम्यूनोस्टेनिंग/इम्यूनोफ्लोरेसेंस सहित16.
चूहों में अस्थायी रूप से प्रेरक रिपोर्टर टूल के अन्य तरीकों में क्रे-ईआरटी 2 चूहों का उपयोग शामिल है, जिसे आरओएसए-जीएफपी, आरओएसए-एमटीएमजी या अन्य फ्लोरोसेंट रिपोर्टर ट्रांसजीन के साथ जोड़ा जा सकता है। इन जानवरों में, एक सेल-विशिष्ट नियामक तत्व, जैसे कि ब्याज का प्रमोटर या एन्हांसर क्षेत्र, क्रे रीकॉम्बिनेज के उत्पादन को चलाता है, जिसे केवल टैमोक्सीफेन के प्रशासन के माध्यम से सक्रिय किया जा सकता है। जबकि क्रे-ईआरटी 2 माउस लाइनें विशिष्ट सेल लाइनों में क्रे के प्रेरण की अनुमति देती हैं, वयस्क न्यूरोजेनेसिस17,18 पर टैमोक्सीफेन के प्रभावों का विवरण देने वाले ज्ञान का खजाना है। इसके अतिरिक्त, कई आरओएसए-संचालित फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन मौजूद हैं जिनका उपयोग जीएफपी या एमटीएमजी के बजाय किया जा सकता है, जिसमें वाईएफपी या सीएफपी शामिल हैं, जो अन्य फ्लोरोसेंट तरंग दैर्ध्य में वैकल्पिक फ्लोरोसेंट लेबलिंग की अनुमति देगा। इन फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन का उपयोग टेट-ऑन या क्रे-ईआरटी 2 सिस्टम के साथ किया जा सकता है।
टेलोमेरेज़ रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (टीईआरटी) होलोएंजाइम टेलोमेरेज़ का दर-सीमित घटक है, जो कोशिका विभाजन19,20 के दौरान छोटा होने के बाद टेलोमेरेस का विस्तार करने के लिए काम करता है। टीईआरटी को आंत21,22, अस्थि मज्जा 21, यकृत 23, वसा 24, एंडोमेट्रियम 25,26 और हड्डी 1 में वयस्क ऊतक स्टेम कोशिकाओं के मार्कर के रूप में पहचाना गयाहै। क्या इन वयस्क स्टेम कोशिकाओं में टीईआरटी अभिव्यक्ति पूरी तरह से टेलोमेरेज़-विस्तार गतिविधि के लिए है या गैर-विहित टीईआरटी भूमिकाएं27 करने के लिए अभी भी अज्ञात है। टीईआरटी-एक्सप्रेसिंग क्विसेंट वयस्क स्टेम सेल (क्यूएएससी) की पहचान की गई है और इन स्टेम कोशिकाओं की मल्टीपोटेंसी और आत्म-नवीकरण क्षमता का अध्ययन करने के लिए ट्रांसजेनिक वंश अनुरेखण चूहों के साथ पूरे शरीर में पता लगाया गया है, साथ ही 1,22,23,28 को सक्रिय करने, प्रसारित करने, अंतर करने और माइग्रेट करने की उनकी क्षमता का अध्ययन किया गया है। टर्ट-आरटीटीए ट्रांसजीन का निर्माण पहले किया गया है1. इस पत्र में, हम टीईआरटी + क्यूएएससी का अध्ययन करने के लिए एक वंश अनुरेखण टीईआरटी माउस लाइन के उपयोग का वर्णन करेंगे जिसे हमने वयस्क माउस मस्तिष्क में एक उपन्यास एएससी आबादी के रूप में पहचाना है।
एक ट्रांसजेनिक वंश ट्रेसिंग माउस लाइन की पीढ़ी
टेट-ऑन सिस्टम का उपयोग करके वंश-अनुरेखण माउस लाइन उत्पन्न करने के लिए, माउस संभोग के माध्यम से एक ही जानवर के भीतर तीन ट्रांसजीन को जोड़ा जाना चाहिए। पहला एक आरटीटीए है, जो ब्याज के जीन के प्रमोटर के नियंत्रण में व्यक्त किया गया है (हमारा टीईआरटी-आरटीटीए है)। एक सेल में जो ब्याज के इस जीन को व्यक्त करता है, इसलिए आरटीटीए व्यक्त किया जाएगा। दूसरा एक ओटेट-क्रे जीन है, जिसमें एक टेट्रासाइक्लिन प्रतिक्रिया तत्व (टीआरई) होता है जो आरटीटीए संलयन प्रतिलेख और टेट्रासाइक्लिन या डॉक्सीसाइक्लिन दोनों की उपस्थिति में क्रे रिकॉम्बिनेज के प्रतिलेखन की अनुमति देगा। टेट्रासाइक्लिन या डॉक्सीसाइक्लिन को पीने के पानी या चाउ29 के माध्यम से एक जानवर को प्रशासित किया जा सकता है। अंत में, एक जीन होना चाहिए जो क्रे पुन: संयोजक दरार द्वारा सक्रिय किया जाएगा। इस पांडुलिपि में, हम जिस लेबलिंग जीन का वर्णन करेंगे वह रोजा 26-एमटीएमजी जीन है, जो क्रे पुनर्संयोजन तक सर्वव्यापी रूप से एमटीमैटो (सभी कोशिकाओं में झिल्ली लाल प्रतिदीप्ति) को ट्रांसक्रिप्ट करेगा। हालांकि, यदि कोई कोशिका आरटीटीए प्रतिलेख व्यक्त करती है और इसमें टेट्रासाइक्लिन या डॉक्सीसाइक्लिन होता है, तो एमटीमैटो और एमजीएफपी साइटों के बीच लॉक्स पी साइटों के एक सेट का क्रे पुनर्संयोजन आर 26 साइट को बदल देगा और कोशिका को झिल्ली टमाटर के बजाय झिल्ली ईजीएफपी (एमजीएफपी, या झिल्ली हरी प्रतिदीप्ति) का उत्पादन करने का कारण बनेगा। इस एमजीएफपी सिग्नल की अमिट प्रकृति विवो लेबलिंग और कोशिकाओं के अनुरेखण की अनुमति देगी क्योंकि वे फैलते हैं, पलायन करते हैं और अंतर करते हैं। ट्रेस के बाद, मानक क्रायोसेक्शन या मोटे ऑप्टिकली साफ़ दिमाग में इम्यूनोफ्लोरेसेंस के माध्यम से जीएफपी की अभिव्यक्ति के लिए कोशिकाओं का विश्लेषण किया जा सकता है।
इस पत्र में, हम विशिष्ट माउस लाइन के उपयोग का वर्णन करेंगे, एमटीईआरटी-आरटीटीए :: ओटेट-क्रे :: रोजा-एमटीएमजी। इस ट्रिपल ट्रांसजेनिक माउस लाइन को बनाने के लिए, हमने पहले ओटेट-क्रे जानवरों (जैक्सन लैब स्ट्रेन # 006234) को रोजा-एमटीएमजी जानवरों (जैक्सन लैब स्ट्रेन # 007676) को ओटेट-क्रे :: रोजा-एमटीएमजी डबल ट्रांसजेनिक चूहों को बनाने के लिए मिलाया। इन जानवरों को पूरक तालिका 1 और 2 में इंगित प्राइमर और पीसीआर टेम्पलेट्स के साथ जीनोटाइप किया गया था। एमटीईआरटी-आरटीटीए चूहों (डेविड ब्रेउल्ट1 द्वारा निर्मित) को ओटेट-क्रे :: रोजा-एमटीएमजी जानवरों को एमटर्ट-आरटीटीए :: ओटेट-क्रे :: रोजा-एमटीएमजी चूहों (चित्रा 1 ए) 1,30 बनाने के लिए मिलाया गया था। एमटीईआरटी-आरटीटीए :: ओटेट-क्रे :: रोजा-एमटीएमजी माउस लाइन की कार्रवाई का तंत्र चित्रा 1 बी में सचित्र है।
डॉक्सीसाइक्लिन प्रेरण और पल्स-चेस डिजाइन
प्रयोगों की योजना बनाते समय, कई कारकों पर विचार करना महत्वपूर्ण है जो वंश अनुरेखण प्रयोगों के परिणाम को प्रभावित करेंगे, जिसमें डॉक्सीसाइक्लिन प्रेरण में जानवर की उम्र, डॉक्सीसाइक्लिन प्रशासन (“पल्स” अवधि) की लंबाई, ऊतक संग्रह से पहले डॉक्सीसाइक्लिन हटाने के बाद समय की लंबाई (“पीछा” अवधि), और इन प्रक्रियाओं के दौरान किसी भी हस्तक्षेप का समय शामिल है। प्रयोग के समापन पर लेबल कोशिकाओं और उनकी संतान को समझने के लिए ये अध्ययन डिजाइन विचार आवश्यक हैं। प्रक्रिया में पहला कदम जानवर की रुचि की उम्र और डॉक्सीसाइक्लिन प्रशासन की लंबाई की पहचान करना है। लंबी नाड़ी अवधि आरटीटीए से जुड़े प्रमोटर को व्यक्त करने के लिए अधिक कोशिकाओं की क्षमता की अनुमति देगी और ब्याज की अधिक कोशिकाओं को अमिट रूप से चिह्नित किया जाएगा। एक सेल प्रकार जो ब्याज के जीन की क्षणिक अभिव्यक्ति को प्रदर्शित करता है, उसे कोशिकाओं की तुलना में लंबी नाड़ी अवधि की आवश्यकता हो सकती है जो लगातार ब्याज के जीन को व्यक्त करते हैं। हालांकि, यदि अध्ययन का लक्ष्य ब्याज की कोशिका या तीव्र हस्तक्षेप के अल्पकालिक प्रभावों को समझना है, तो नाड़ी अवधि बहुत लंबी नहीं हो सकती है, क्योंकि एक बार एक कोशिका को चिह्नित करने के बाद, शेष पल्स अवधि के दौरान किसी भी संख्या में परिवर्तनों के माध्यम से इसका पता लगाया जाएगा। हमारे कुछ अध्ययनों में, टीईआरटी के लिए प्रत्यक्ष-रिपोर्टर की अधिक बारीकी से नकल करने के लिए बिना किसी पीछा अवधि के 2 दिन की नाड़ी का उपयोग किया गया था। ऐसा इसलिए है क्योंकि रोजा-एमटीएमजी जीन के पुनर्संयोजन के लिए समय की न्यूनतम लंबाई 2 दिन31 है।
पल्स-चेस प्रयोग में अगली आवश्यक अवधि डॉक्सीसाइक्लिन को हटाने और जानवर के छिड़काव के बीच की लंबाई है, जिसे ‘पीछा’ के रूप में भी जाना जाता है। चूहों में डॉक्सीसाइक्लिन का आधा जीवन प्रशासन मार्ग की परवाह किए बिना लगभग 170 मिनट है, जिससे यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि डॉक्सीसाइक्लिन प्रेरणअब हटाने के कई घंटों बाद नहीं हो रहा है 32। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि वृद्ध चूहों में डॉक्सीसाइक्लिन चयापचय धीमा है, जिससे युवा जानवरों की तुलना में लंबे समय तक प्रभावी ‘पल्स’ अवधि हो सकतीहै 33.
पीछा अवधि के दौरान, प्रसार, भेदभाव या माइग्रेशन के बाद भी लेबल वाली कोशिकाओं को लेबल किया जाना जारी रहेगा। इन कोशिकाओं की संतान को भी लेबल किया जाएगा। अध्ययन का लक्ष्य नाड़ी-पीछा प्रतिमान की लंबाई को आकार देगा। यदि अध्ययन का लक्ष्य ब्याज की कोशिकाओं के साथ लंबे समय तक ऊतक के उत्थान को समझना है, तो लंबी पीछा अवधि की आवश्यकता हो सकती है। अंत में, किसी भी हस्तक्षेप या उपचार का समय तय किया जाना चाहिए। नाड़ी अवधि के दौरान प्रशासन ब्याज के जीन के साथ-साथ इस समय के दौरान बनाई गई किसी भी संतान को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को प्रभावित करेगा, जबकि पीछा अवधि के दौरान प्रशासन ब्याज की कोशिकाओं की ज्यादातर संतानों को प्रभावित कर सकता है, हालांकि यह इस बात पर निर्भर करेगा कि लेबल वाली कोशिकाएं कितनी जल्दी विभाजित या अंतर करती हैं। पल्स-चेस प्रयोगात्मक डिजाइनों के उदाहरण जो हमने उपयोग किए हैं , चित्रा 2 ए में उल्लिखित हैं।
टपका हुआ अभिव्यक्ति के कारण पृष्ठभूमि जीएफपी सिग्नल की संभावना से अवगत होना भी महत्वपूर्ण है। टपका हुआ अभिव्यक्ति डॉक्सीसाइक्लिन की अनुपस्थिति में आरटीटीए और ओटेट अनुक्रमों के बीच अंतर्निहित बाध्यकारी क्षमता के परिणामस्वरूप होती है, और आरटीटीए की अनुपस्थिति में ओटेट ट्रांसजीन की अवशिष्ट गतिविधि (34 में समीक्षा की गई)। टपका हुआ अभिव्यक्ति टेट सिस्टम की एक कमजोरी का प्रतिनिधित्व करती है, और यद्यपि रिसाव अक्सर सिस्टम के लिए एक स्वीकार्य नकारात्मक पक्ष होता है, ऐसी स्थितियां जहां टपका हुआ अभिव्यक्ति विषाक्तता और मृत्यु दर का कारण बन सकती है, जैसे कि ओटेट-डीटीए जानवरों में डिप्थीरिया विष (डीटीए) इन प्रणालियों के उपयोग को सीमित कर सकता है35.
माइक्रोस्कोपी के लिए पतले वर्गों के मस्तिष्क प्रसंस्करण, सेक्शनिंग और इम्यूनोफ्लोरेसेंस
वंश अनुरेखण प्रयोग के बाद चूहों के दिमाग का विश्लेषण करने के लिए, चूहों को पहले रक्त और सीएसएफ को हटाने के लिए ट्रांसकार्डियल छिड़काव के माध्यम से सुगंधित किया जाना चाहिए जो मस्तिष्क में उच्च ऑटोफ्लोरेसेंस का कारण बन सकता है। दो आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले फिक्सेटिव हैं जिनके साथ जानवर को सुगंधित किया जा सकता है: हिस्टोचॉइस टिशू फिक्सेटिव, एक ग्लाइक्सल फिक्सेटिव (जीएफ), या 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए)। ग्लाइक्सल फिक्सेटिव पीएफए की तुलना में कम क्रॉस-लिंकिंग के साथ अपेक्षाकृत कोमल निर्धारण प्रक्रिया की अनुमति देते हैं। यह ऊतक कठोरता को कम करता है, एंटीजन पुनर्प्राप्ति की आवश्यकता को कम करता है, और इम्यूनोस्टेनिंग के दौरान कम केंद्रित एंटीबॉडी समाधान की अनुमति देता है। हालांकि, अगर उनमें मेथनॉल होता है तो यह ऑटोफ्लोरेसेंस36 को बढ़ाने का काम कर सकता है। दूसरी ओर, पीएफए अक्सर अधिक मजबूत निर्धारण की अनुमति देगा, और जबकि इम्यूनोस्टेनिंग के दौरान एंटीजन पुनर्प्राप्ति की आवश्यकता होगी, एंटीबॉडी हैं जो केवल पीएफए-निश्चित ऊतकों के साथ काम करेंगे, और बाद में वर्णित ऑप्टिकल क्लियरिंग तकनीक के लिए 4% पीएफए के साथ छिड़काव आवश्यक है।
छिड़काव के बाद एक पोस्ट-फिक्सेशन कदम है, जिसमें मस्तिष्क को रात भर छिड़काव के दौरान उपयोग किए जाने वाले एक ही प्रकार के फिक्सेटिव में डुबोया जाता है। यह किसी भी मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए अनुमति देता है जो छिड़काव के दौरान पूरी तरह से तय नहीं हो सकते हैं ताकि ठीक करना जारी रखा जा सके। अगला, ऊतक (“क्रायो-संरक्षण”) के भीतर बर्फ के गठन को रोकने के लिए ठंड कदम से पहले जितना संभव हो उतना पानी निकालने के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में सुक्रोज में मस्तिष्क को ऊष्मायन किया जाएगा। मस्तिष्क को तब प्रसंस्करण के लिए धनु, कोरोनल या अनुप्रस्थ ऊतक वर्गों की किसी भी संख्या में काटा जा सकता है। परिशुद्धता और प्रजनन क्षमता दोनों के लिए, कैलिब्रेटेड मस्तिष्क ब्लॉक का उपयोग इस तरह से किया जाना चाहिए जो जानवरों के बीच लगातार ब्रेग्मा कटौती सुनिश्चित करता है। सबसे महत्वपूर्ण कारक जो प्रभावित कर सकता है कि मस्तिष्क को कैसे विभाजित किया जाता है, ब्याज का मस्तिष्क क्षेत्र (ओं) है। उदाहरण के लिए, जबकि एक धनु कटौती एक ऊतक अनुभाग में अधिक मस्तिष्क क्षेत्रों का विश्लेषण करने की अनुमति दे सकती है, यह कटौती वेंट्रिकुलर-सबवेंट्रिकुलर ज़ोन (वी-एसवीजेड) के न्यूरो / ग्लियोजेनिक क्षेत्रों के विश्लेषण की अनुमति नहीं देगी क्योंकि पार्श्व वेंट्रिकल के पार्श्व और औसत दर्जे का पक्ष उस आयाम में समझना असंभव होगा और कोरोनल विमान में बेहतर मनाया जाएगा। यह वयस्क न्यूरोजेनेसिस अध्ययनों में बनाने के लिए एक महत्वपूर्ण अंतर हो सकता है, क्योंकि पार्श्व वेंट्रिकल के पार्श्व पक्ष में न्यूरोजेनिक वी-एसवीजेड होता है, जबकि पार्श्व वेंट्रिकल की औसत दर्जे की दीवार एक अधिक ग्लियोजेनिक आला37 है।
ऊतकों को कोरोनल, धनु, या अनुप्रस्थ वर्गों में विभाजित करने के बाद, उन्हें इष्टतम शीतलन तापमान (ओसीटी) एम्बेडिंग समाधान का उपयोग करके ब्लॉक में जमे हुए किया जाएगा। यहां, सूखी बर्फ और इथेनॉल के मिश्रण के उपयोग के साथ, इस एम्बेडिंग सामग्री के भीतर दिमाग जमे हुए हैं। यदि पतले अनुभाग विश्लेषण की आवश्यकता होती है, तो ब्लॉक को क्रायोस्टैट पर काट दिया जाएगा, और आवश्यक डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के आधार पर सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए ग्लास स्लाइड्स को पतले वर्गों (<20 μm) के रूप में पालन किया जा सकता है। ग्लास स्लाइड जो चार्ज नहीं की जाती हैं, उनका भी उपयोग किया जा सकता है, लेकिन अनचार्ज की गई स्लाइड्स के उपयोग के परिणामस्वरूप स्लाइड38 से ऊतक अनस्टक हो सकते हैं। यदि मध्यम मोटाई मुक्त-फ्लोटिंग ऊतक वर्गों (>20 μm) की आवश्यकता होती है, तो ऊतकों को मुक्त-फ़्लोटिंग वर्गों के रूप में एकत्र किया जाएगा। यदि मोटे वर्गों (0.5-4 मिमी) की आवश्यकता होती है, तो वाइब्रेटोम के साथ गैर-जमे हुए मस्तिष्क वर्गों को टुकड़ा करने की आवश्यकता होती है। स्लाइड पर वर्गों के बीच भंडारण अंतर को नोट करना महत्वपूर्ण है, जिसके लिए -20 से -80 डिग्री सेल्सियस और फ्री-फ्लोटिंग सेक्शन पर ठंड की आवश्यकता होती है, जिसे 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाएगा।
मस्तिष्क समाशोधन और पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरोसेंट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी
यदि माउस मस्तिष्क में वंश-पता लगाए गए कोशिकाओं का एक व्यापक, अभी तक कम विस्तृत विश्लेषण वांछित है, तो मस्तिष्क के ऊतकों के मोटे खंडों का व्यापक विश्लेषण आईडीआईएससीओ मस्तिष्क समाशोधन39 के साथ संभव है, इसके बाद इम्यूनोस्टेनिंग और टाइल्ड जेड-स्टैक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी या लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी। यहां, माउस मस्तिष्क के बड़े वर्गों को ऑप्टिकल रूप से साफ़ किया जाएगा (डिलिपिडेशन39 की एक प्रक्रिया), जो 1 मिमी ऊतक अनुभाग में फ्लोरोसेंट सिग्नल इमेजिंग के लिए बेहतर अनुमति देता है। इस प्रक्रिया के डाउनसाइड्स उच्च ऑटोफ्लोरेसेंस और सेल आकृति विज्ञान की उच्च रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्राप्त करने की कम क्षमता और अधिक पारंपरिक तरीकों (पतली क्रायोसेक्शन या फ्री-फ्लोटिंग सेक्शन) की तुलना में आवश्यक कामकाजी दूरी में वृद्धि के कारण विस्तृत सह-धुंधला विश्लेषण हैं। इस कारण से, हम व्यक्तिगत कोशिकाओं को चिह्नित करने या विश्लेषण करने का प्रयास करने के बजाय, कई मस्तिष्क क्षेत्रों में बड़े पैमाने पर वंश अनुरेखण परिणामों का विश्लेषण करने के लिए मस्तिष्क समाशोधन की सलाह देते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
विवो में वयस्क माउस मस्तिष्क के भीतर स्टेम कोशिकाओं को चिह्नित करने वाली ट्रिपल ट्रांसजेनिक वंश ट्रेसिंग माउस लाइन के निर्माण, उपयोग और विश्लेषण के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। जब इम्यूनोस्ट?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
डायना कार्लोन (बोस्टन चिल्ड्रन हॉस्पिटल, हार्वर्ड मेडिकल स्कूल) और डॉ मैथ्यू लिन्स (जोसलिन डायबिटीज सेंटर; मेन मेडिकल सेंटर रिसर्च इंस्टीट्यूट) एमटीईआरटी-आरटीटीए जानवरों का उपयोग करके मार्गदर्शन के लिए।
Materials
| Antibody diluent | Agilent | S080983-2 | |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent | S2367 | |
| anti-GFP antibody | Invitrogen | A2311 | Use at 1:500-1:000 |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | |
| B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J | The Jackson Laboratory | JAX:006234 | |
| B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX:007676 | |
| Blocking Solution (IHC) | Millipore Sigma | 20773 | |
| Blunt needle | BSTEAN | X0012SYHIV | |
| Coronal brain block | Braintree | BS-2000C | |
| Cover slip | Corning | 2850-22 | |
| Cryostat | Leica | CM1900 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D564 | |
| Dibenzyl ether | Millipore Sigma | 33630 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Doxycycline Hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0718 | |
| Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative | Amresco | H120 | This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265) |
| Hydrogen Peroxide Solution | Sigma-Aldrich | 516813 | |
| IHC Select TBS Rinse Buffer | Millipore Sigma | 20845 | |
| Ketamine | Westward | 0143-95095-10 | This product requires a DEA license for storage and use. |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Milipore Block | Millipore | 20773 | |
| Mounting medium | Millipore Sigma | 5013 | |
| Optimal Cutting Temperature Solution | Sakura | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS Solution (10X) | Teknova | P0496 | |
| Sagittal brain block | Braintree | RBM-2000S | |
| Saline | Braun | S8004-5264 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Sudan (Typogen) Black | Millipore Sigma | 199664 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 186562 | |
| Tissue cartridge | Simport | M512 | |
| Triton X-100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween-20 | Millipore Sigma | 655205 | |
| Xylazine | AnaSed | sc-362950Rx |
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