Summary

בידוד ותרבית FACS של אבות פיברו-אדיפוגניים ותאי גזע של שרירים משרירי שלד עכברים לא מופרעות ופצועים

Published: June 08, 2022
doi:

Summary

הזיהוי המדויק של תאי אב פיברו-אדיפוגניים (FAPs) ותאי גזע של שרירים (MuSCs) הוא קריטי לחקר תפקודם הביולוגי בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. פרוטוקול זה מספק הנחיות לבידוד, לטיהור ולתרבות של FAPs ו-MuSCs משרירי עכברים בוגרים.

Abstract

תאי אב פיברו-אדיפוגניים (FAPs) הם אוכלוסייה של תאים סטרומליים מזנכימליים (MSCs) המתגוררים בשרירי השלד, המסוגלים להתמיין לאורך שושלת פיברוגנית, אדיפוגנית, אוסטאוגנית או כונדרוגנית. יחד עם תאי גזע של שרירים (MuSCs), FAPs ממלאים תפקיד קריטי בהומאוסטזיס שרירים, בשיקום ובהתחדשות, תוך שמירה פעילה ועיצוב מחדש של המטריצה החוץ-תאית (ECM). במצבים פתולוגיים, כגון נזק כרוני ודיסטרופיות שרירים, FAPs עוברים הפעלה חריגה ומתמיינים לפיברובלסטים ואדיפוציטים המייצרים קולגן, מה שמוביל לפיברוזיס ולחדירת שומן תוך שרירית. לפיכך, FAPs ממלאים תפקיד כפול בהתחדשות שרירים, בין אם על ידי שמירה על תחלופת MuSC וקידום תיקון רקמות או תרומה ליצירת צלקות פיברוטיות וחדירת שומן חוץ רחמי, הפוגעים בשלמות ובתפקוד של רקמת שריר השלד. טיהור נכון של FAPs ו- MuSCs הוא תנאי מוקדם להבנת התפקיד הביולוגי של תאים אלה בתנאים פיזיולוגיים כמו גם בתנאים פתולוגיים. במאמר זה נתאר שיטה מתוקננת לבידוד סימולטני של FAPs ו-MuSCs משרירי גפיים של עכברים בוגרים באמצעות מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנציה (FACS). הפרוטוקול מתאר בפירוט את הדיסוציאציה המכנית והאנזימטית של תאים חד-גרעיניים משרירי גפיים שלמות ומשרירי טיביאליס קדמיים (TA) פצועים. FAPs ו-MuSCs מבודדים לאחר מכן באמצעות סדרן תאים אוטומטי למחצה כדי להשיג אוכלוסיות תאים טהורות. בנוסף, אנו מתארים שיטה אופטימלית לגידול FAPs ו-MuSCs שקטים ומופעלים, לבד או בתנאי קולקולטורה.

Introduction

שריר השלד הוא הרקמה הגדולה ביותר בגוף, המהווה ~ 40% ממשקל האדם הבוגר, והוא אחראי על שמירה על יציבה, יצירת תנועה, ויסות חילוף החומרים של האנרגיה הבסיסית וטמפרטורת הגוף1. שרירי השלד הם רקמה דינמית מאוד ובעלת יכולת יוצאת דופן להסתגל למגוון גירויים, כגון לחץ מכני, שינויים מטבוליים וגורמים סביבתיים יומיומיים. בנוסף, שריר השלד מתחדש בתגובה לפגיעה חריפה, מה שמוביל לשיקום מלא של המורפולוגיה והתפקודים שלו2. פלסטיות שרירי השלד מסתמכת בעיקר על אוכלוסייה של תאי גזע שריריים תושבים (MuSCs), המכונים גם תאי לוויין, הממוקמים בין קרום הפלזמה של מיופייבר לבין הלמינההבסיסית 2,3. בתנאים רגילים, MuSCs שוכנים בנישת השרירים במצב שקט, עם חלוקות מעטות בלבד כדי לפצות על תחלופת התאים ולחדש את מאגר תאי הגזע4. בתגובה לפציעה, MuSCs נכנסים למחזור התא, מתרבים, ותורמים ליצירת סיבי שריר חדשים או חוזרים לנישה בתהליך התחדשות עצמית 2,3. בנוסף ל-MuSCs, תחזוקה הומאוסטטית והתחדשות של שרירי השלד מסתמכים על תמיכתה של אוכלוסייה של תאי שריר מקומיים הנקראים אבות פיברו-אדיפוגניים (FAPs)5,6,7. FAPs הם תאים סטרומליים מזנכימליים המוטבעים ברקמת החיבור לשריר ומסוגלים להתמיין לאורך שושלת פיברוגנית, אדיפוגנית, אוסטאוגנית או כונדרוגנית 5,8,9,10. FAPs מספקים תמיכה מבנית ל-MuSCs מכיוון שהם מקור לחלבוני מטריצה חוץ-תאית בנישת תאי הגזע של השריר. FAPs גם מקדמים תחזוקה ארוכת טווח של שרירי השלד על ידי הפרשת ציטוקינים וגורמי גדילה המספקים תמיכה טרופית למיוגנזה ולצמיחת שרירים 6,11. לאחר פגיעה חריפה בשריר, FAPs מתרבים במהירות כדי לייצר נישה חולפת התומכת בשלמות המבנית של השריר המתחדש ומספקת סביבה חיובית לקיום התפשטות והתמיינות של MuSCs באופן פרקריני5. עם התקדמות ההתחדשות, FAPs מנוקים מהשריר הרגנרטיבי על ידי אפופטוזיס, ומספרם חוזר בהדרגה לרמה בסיסית12. עם זאת, בתנאים המעדיפים פגיעה כרונית בשרירים, FAPs גוברים על איתות פרו-אפופטוטי ומצטברים בנישת השרירים, שם הם מתבדלים לפיברובלסטים ואדיפוציטים המייצרים קולגן, מה שמוביל לחדירת שומן חוץ רחמי וליצירת צלקת פיברוטית12,13.

בשל הרב-פוטנטיות שלהם ויכולות ההתחדשות שלהם, FAPs ו- MuSCs זוהו כמטרות פוטנציאליות ברפואה רגנרטיבית לטיפול בהפרעות בשרירי השלד. לכן, כדי לחקור את תפקודם ואת הפוטנציאל הטיפולי שלהם, חשוב ליצור פרוטוקולים יעילים וניתנים לשחזור עבור בידוד ותרבות של FAPs ו- MuSCs.

מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS) יכול לזהות אוכלוסיות תאים שונות על סמך מאפיינים מורפולוגיים כגון גודל וגרעיניות, ומאפשר בידוד ספציפי לתא בהתבסס על שימוש בנוגדנים המכוונים נגד סמני פני השטח של התא. בעכברים בוגרים, MuSCs מבטאים את מולקולת הידבקות תאי כלי הדם 1 (VCAM-1, הידועה גם בשם CD106)14,15 ו-α7-Integrin15, בעוד ש-FAPs מבטאים את α הקולטן של גורם הגדילה שמקורו בטסיות (PDGFRα) ואת האנטיגן של תאי הגזע 1 (Sca1 או Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 . בפרוטוקול המתואר כאן, MuSCs זוהו כ-CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, בעוד ש-FAPs זוהו כ-CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. לחלופין, נעשה שימוש בעכברי PDGFRαEGFP כדי לבודד FAPs כ-CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- אירועים18,19. יתר על כן, השווינו את החפיפה בין האות הפלואורסצנטי של תאי PDGFRα-GFP+ לתאים שזוהו על ידי סמן פני השטח Sca1. הניתוח שלנו הראה כי כל התאים המבטאים GFP היו חיוביים גם עבור Sca1, מה שמצביע על כך שניתן להשתמש בכל אחת מהגישות לזיהוי ובידוד של FAPs. לבסוף, צביעה עם נוגדנים סמנים ספציפיים אישרה את הטוהר של כל אוכלוסיית תאים.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים שבוצעו נערכו בהתאם להנחיות מוסדיות שאושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים (ACUC) של המכון הלאומי לדלקת פרקים, שלד-שריר ומחלות עור (NIAMS). חוקרים המבצעים פרוטוקול זה חייבים לציית להנחיות האתיקה המקומיות שלהם לגבי בעלי חיים. הערה: פרוטוקול זה מתאר בפיר…

Representative Results

פרוטוקול זה מאפשר בידוד של כמיליון FAPs ועד 350,000 MuSCs מגפיים אחוריות לא מרוטשות של עכברים בוגרים מסוג בר (3-6 חודשים), המקביל לתשואה של 8% עבור FAPs ו-3% עבור MuSCs של סך האירועים. בעת מיון תאים מת”א פגום 7 ימים לאחר הפציעה, שניים עד שלושה שרירי TA מאוגדים כדי לקבל עד 300,000 FAPs ו-120,000 MuSCs, התואמים לתשואה של 11% ו-4%…

Discussion

קביעת פרוטוקולים יעילים וניתנים לשחזור לזיהוי ובידוד של אוכלוסיות תאי גזע בוגרים טהורים היא הצעד הראשון והקריטי ביותר לקראת הבנת תפקידם. ניתן להשתמש ב-FAPs וב-MuSCs מבודדים כדי לבצע ניתוח מולטיומיקה בניסויי השתלה כטיפול פוטנציאלי במחלות שרירים או שניתן להנדס גנטית עבור מודלים של מחלות בטיפו…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ברצוננו להודות לטום צ’אונג (אוניברסיטת הונג קונג למדע וטכנולוגיה) על עצות בנושא בידוד MuSC. עבודה זו מומנה על ידי NIAMS-IRP באמצעות מענקי NIH AR041126 ו- AR041164.

Materials

5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Falcon 352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap Falcon 352235
20 G BD Needle 1 in. single use, sterile BD Biosciences  305175
anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) The University of British Columbia 53-0010-01
APC anti-mouse CD31 Antibody BioLegend 102510
APC anti-mouse CD45 Antibody BioLegend 103112
BD FACSMelody Cell Sorter BD Biosciences 
BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL BD Biosciences  309604
Biotin anti-mouse CD106 Antibody BioLegend 105703
C57BL/6J  mouse (Female and Male) The Jackson Laboratory 000664
B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse The Jackson Laboratory 007669
Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate Corning 356400
Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate Corning 356500
Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate Corning 356408
DAPI Solution (1 mg/mL) ThermoFisher Scientific 62248
Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile VWR 414004-265
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-11055
Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile Corning 352340
Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile Corning 353002
Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL VWR 352196
Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL Corning 352070
Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning VWR 60819-728
Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning VWR 21008-948
Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) Promega G5071
FlowJo 10.8.1
Gibco Collagenase, Type II, powder ThermoFisher Scientific 17101015
Gibco Dispase, powder ThermoFisher Scientific 17105041
Gibco DMEM, high glucose, HEPES ThermoFisher Scientific 12430054
Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States ThermoFisher Scientific 16000044
Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix ThermoFisher Scientific 11550043
Gibco Horse Serum, New Zealand origin ThermoFisher Scientific 16050122
Gibco PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010023
Gibco PBS (10x), pH 7.4 ThermoFisher Scientific 70011044
Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) ThermoFisher Scientific 10378016
Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 ThermoFisher Scientific A-21127
Hardened Fine Scissors Fine Science Tools Inc 14090-09
Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) ThermoFisher Scientific A1310
Mouse PDGF R alpha Antibody R&D Systems AF1062
Normal Donkey Serum Fisher Scientific NC9624464
Normal Goat Serum ThermoFisher Scientific 31872
Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody BioLegend 108120
Paraformaldehyde, 16% Fisher Scientific NCC0528893
Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) Developmental Study Hybridoma Bank N/A
PE/Cyanine7 Streptavidin BioLegend 405206
Student Vannas Spring Scissors Fine Science Tools Inc 91500-09
Student Dumont #5 Forceps Fine Science Tools Inc 91150-20
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787

References

  1. Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. Muscle as a "mediator" of systemic metabolism. Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).
  2. Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
  3. Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
  4. Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers. Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).
  5. Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
  6. Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
  7. Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging. Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).
  8. Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
  9. Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
  10. Eisner, C., et al. Murine tissue-resident PDGFRα+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).
  11. Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).
  12. Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
  13. Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9, 3670 (2018).
  14. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  15. Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).
  16. Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).
  17. Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).
  18. Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
  19. Contreras, O., et al. Cross-talk between TGF-β and PDGFRα signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors. Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).
  20. Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma. Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).
  21. Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert. Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).
  22. García-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
  23. Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
  24. Walls, P. L. L., et al. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
  25. Kafadar, K. A., et al. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. 发育生物学. 326 (1), 47-59 (2009).

Play Video

Cite This Article
Riparini, G., Simone, J. M., Sartorelli, V. FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (184), e63983, doi:10.3791/63983 (2022).

View Video