Un enfoque fotodinámico para estudiar la función de la ruptura de vesículas intracelulares
Summary
La inactivación láser asistida por cromóforo (CALI) mediada por AlPcS2a es una poderosa herramienta para estudiar el daño espaciotemporal de vesículas intracelulares (IV) en células vivas.
Abstract
Las vesículas intracelulares (IV) se forman a través de la endocitosis de vesículas en citoplasma. La formación IV está involucrada en la activación de varias vías de señal a través de la permeabilización de las membranas IV y la formación de endosomas y lisosomas. Se aplica un método llamado inactivación láser asistida por cromóforos (CALI) para estudiar la formación de IV y los materiales en el control de la regulación IV. CALI es una metodología fotodinámica basada en imágenes para estudiar la vía de señalización inducida por la permeabilización de la membrana. El método permite la manipulación espaciotemporal del orgánulo seleccionado para ser permeabilizado en una célula. El método CALI se ha aplicado para observar y monitorizar moléculas específicas mediante la permeabilización de endosomas y lisosomas. Se sabe que la ruptura de la membrana de las vías intravenosas recluta selectivamente proteínas de unión a glicanos, como la galectina-3. Aquí, el protocolo describe la inducción de la ruptura IV por AlPcS2a y el uso de galectina-3 como marcador para marcar lisosomas deteriorados, lo cual es útil para estudiar los efectos posteriores de la ruptura de la membrana IV y sus efectos aguas abajo en diversas situaciones.
Introduction
Los endosomas, un tipo de vesícula intracelular (IV), se forman por endocitosis y luego maduran en lisosomas. Varias vías de señal intracelular están involucradas en la formación de IV; además, diferentes estímulos intrínsecos y extrínsecos pueden dañar las vías intravenosas (por ejemplo, los patógenos pueden escapar de la membrana limitada durante la infección y entrar en el citoplasma1). Esto suele ir acompañado de la ruptura de vesículas endocitóticas2. Por lo tanto, las técnicas para atacar y dañar las IV pueden ser utilizadas en estudios relacionados3.
La terapia fotodinámica (TFD) es una terapia dependiente de la luz para combatir enfermedades matando tumores o patógenos4. En la TFD, las células diana son marcadas con cromóforos no tóxicos, llamados fotosensibilizadores, que pueden ser activados localmente por la iluminación de la luz 5,6. Los fotosensibilizadores absorben la energía de la luz y se transforman en un estado singlete excitado, lo que lleva al estado de triplete excitado de larga duración. Los fotosensibilizadores del estado triplete pueden sufrir transferencia de electrones o energía y formar especies reactivas de oxígeno (ROS) en presencia de oxígeno, y pueden destruir espacialmente las células marcadas dentro de la región de iluminación7. La consecuencia varía dependiendo de la potencia de la luz8. Al controlar la concentración de fotosensibilizadores y la intensidad de la iluminación de la luz, las biomoléculas objetivo pueden inactivarse selectivamente sin lisis celular, denominada inactivación de la luz asistida por cromóforos (CALI)9. Con el desarrollo significativo de fotosensibilizadores que pueden etiquetar selectivamente varios objetivos subcelulares, CALI se ha convertido en una herramienta valiosa para controlar la inactivación mediada por luz de biomoléculas para biomoléculas pequeñas como nucleótidos y proteínas, así como orgánulos como mitocondrias y endolisosomas 3,10,11,12,13.
En comparación con CALI, también se utilizan métodos químicos o físicos para dañar las membranas, como la toxina bacteriana 14,15 y el tratamiento con Leu-Leu-OMe16 para el daño lisosomal. Sin embargo, estos métodos muestran un deterioro masivo de las vías intravenosas dentro de las células. En la CALI se utilizan fotosensibilizadores robustos (es decir, ácido disulfónico cloruro de ftalocianina Al(III) (AlPcS2a)); AlPcS2a, dirigido a los lisosomas a través de endocitosis, se utiliza para romper endosomas o lisosomas en una región controlada17. AlPcS2a es un cromóforo basado en ftalocianina impermeable a la membrana celular que se une a los lípidos en la membrana plasmática y se internaliza a través de la endocitosis y finalmente se acumula dentro del lisosoma a través de la vía endocítica18. Absorbe la luz dentro de una región espectral del infrarrojo cercano y genera oxígeno singlete, un ROS importante generado por AlPcS2a 18 excitado. La descomposición del oxígeno singlete limita rápidamente su difusión y distancia de reacción dentro de una pequeña región en las células (aproximadamente 10-20 nm)19. Al ajustar la duración de la incubación de AlPcS2a y la iluminación de la luz, se permite el control espacio-temporal del daño de las vías intravenosas dentro de un área subcelular. Por lo tanto, CALI se convierte en una herramienta poderosa para examinar las consecuencias del daño IV y la formación y regulación de las IV.
En este estudio, se aborda un protocolo específico de CALI utilizando AlPcS2a como fotosensibilizador. Este protocolo se puede aplicar a varios tipos de IV, incluidos endosomas y lisosomas, y se puede utilizar para examinar las respuestas de seguimiento después de la ruptura de la membrana. Las células HeLa que expresan galectina-3 conjugada con fluoróforos16,20 reveladas después de la ruptura del lisosoma se utilizan para demostrar este protocolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
AlPcS 2a se une a la membrana plasmática, luego es internalizado por endocitosis y finalmente seacumula en los lisosomas. Por lo tanto, AlPcS2a se puede localizar en los compartimentos subcelulares ajustando la duración de la incubación. Una limitación de esta metodología es que solo una subpoblación de IV podría ser etiquetada por AlPcS2a a través de endocitosis porque hay muchas otras fuentes de membrana de IV, como ER y aparato de Golgi. Además, el etiquetado selectivo de AlPc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a la Academia Sinica Inflammation Core Facility, IBMS por el apoyo a la investigación. La instalación central está financiada por el Proyecto de Instrumento Innovador y Instalación Central de la Academia Sínica (AS-CFII-111-213). Los autores agradecen a Common Equipment Core Facility del Instituto de Ciencias Biomédicas (IBMS), Academia Sinica (AS) por ayudar a la adquisición de imágenes.
Materials
| Reagent | |||
| Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a) | Frontier Scientific | P40632 | |
| Culture dish | ibidi | 812128-200 | |
| Culture Medium | DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | A4736301 | |
| Gal3-GFP plasmid | addgene | ||
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | green fluorescent dye |
| Multiwall plate | perkinelmer | PK-6005550 | |
| NaOH | Thermo Fisher Scientific | Q15895 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 |
| Cell line | |||
| HeLa Cell Line | ATCC | CCL-2 | The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually. |
| Equipments | |||
| 0.22 µm Filter | Merck | SLGV013SL | |
| Collimated LED Light (660nm) | Thorlabs | M660L3-C1 and DC2100 | Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a. |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM 780 | An incubation system is required for long-term imaging. |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ||
| Red LED light | Tholabs | M660L4-C1 |
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