Une méthode de nettoyage des tissus pour l’imagerie neuronale des échelles mésoscopiques aux échelles microscopiques
Summary
Le protocole fournit une méthode détaillée d’imagerie neuronale dans une tranche de cerveau à l’aide d’une méthode de nettoyage destissus, Sca l eSF. Le protocole comprend la préparation des tissus cérébraux, la clarification des tissus, la manipulation des tranches nettoyées et l’imagerie par microscopie confocale à balayage laser des structures neuronales, des niveaux mésoscopiques aux niveaux microscopiques.
Abstract
Un protocole détaillé est fourni ici pour visualiser les structures neuronales des niveaux mésoscopiques aux niveaux microscopiques dans les tissus cérébraux. Les structures neuronales allant des circuits neuronaux aux structures neuronales subcellulaires sont visualisées dans des tranches de cerveau de souris optiquement nettoyées avec ScaleSF. Cette méthode de nettoyage est une version modifiée de ScaleS et est une méthode de nettoyage des tissus hydrophiles pour les tranches de tissu qui permet d’obtenir une capacité de nettoyage puissante ainsi qu’un haut niveau de préservation des signaux de fluorescence et de l’intégrité structurelle. Une chambre d’imagerie tridimensionnelle (3D) personnalisable est conçue pour un montage fiable des tissus cérébraux nettoyés. Les cerveaux de souris injectés avec un vecteur viral adéno-associé porteur d’un gène de protéine fluorescente verte amélioré ont été fixés avec 4% de paraformaldéhyde et coupés en tranches de 1 mm d’épaisseur avec une trancheuse de tissu vibrante. Les tranches de cerveau ont été éliminées en suivant le protocole de nettoyage, qui comprend des incubations séquentielles dans trois solutions, à savoir la solution ScaleS0, la solution saline tampon phosphate (–) et la solution ScaleS4, pour un total de 10,5 à 14,5 h. Les tranches de cerveau nettoyées ont été montées sur la chambre d’imagerie et incorporées dans du gel d’agarose à 1,5% dissous dans la solution ScaleS4D25(0). L’acquisition d’images 3D des tranches a été réalisée à l’aide d’un microscope à balayage laser confocal équipé d’une lentille d’objectif multi-immersion d’une longue distance de travail. En commençant par l’imagerie neuronale mésoscopique, nous avons réussi à visualiser de fines structures neuronales subcellulaires, telles que les épines dendritiques et les boutons axonaux, dans les tranches de cerveau optiquement dégagées. Ce protocole faciliterait la compréhension des structures neuronales des circuits aux échelles des composants subcellulaires.
Introduction
Les méthodes de nettoyage des tissus ont amélioré l’imagerie indépendante de la profondeur des échantillons biologiques et cliniques avec la microscopie optique, permettant l’extraction d’informations structurelles sur des tissus intacts 1,2. Les techniques de nettoyage optique pourraient également accélérer et réduire le coût de l’analyse histologique. À l’heure actuelle, trois grandes approches de défrichage sont disponibles : les méthodeshydrophiles, hydrophobes et à base d’hydrogel 1,2. Les approches hydrophiles surpassent en préservant les signaux de fluorescence et l’intégrité des tissus et sont moins toxiques que les deux autres approches 3,4.
Une méthode de nettoyage hydrophile, ScaleS, occupe une position distinctive avec sa préservation de l’intégrité structurelle et moléculaire ainsi que sa puissante capacité de nettoyage (spectre de clairance-préservation)5. Dans une étude précédente, nous avons développé un protocole de nettoyage rapide et isométrique, ScaleSF, pour les tranches de tissu (~1 mm d’épaisseur) en modifiant la procédure de nettoyage de ScaleS6. Ce protocole de nettoyage nécessite des incubations séquentielles de tranches de cerveau dans trois solutions pendant 10,5 à 14,5 h. La méthode est dotée d’un spectre de conservation de clairance élevé, compatible même avec l’analyse par microscopie électronique (EM) (figure supplémentaire 1), permettant une imagerie tridimensionnelle (3D) haute résolution à plusieurs échelles avec une reconstruction précise du signal6. Ainsi, ScaleSF devrait être efficace en particulier dans le cerveau, où les cellules neuronales élaborent des processus exubérants d’une longueur énorme et organisent des structures subcellulaires fines spécialisées pour transmettre et recevoir des informations. L’extraction d’informations structurelles avec des échelles allant du circuit aux niveaux subcellulaires sur les cellules neuronales est très utile pour mieux comprendre les fonctions cérébrales.
Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour visualiser les structures neuronales avec des échelles allant du niveau mésoscopique / circuit au niveau microscopique / subcellulaire en utilisant ScaleSF. Le protocole comprend la préparation des tissus, la clarification des tissus, la manipulation des tissus nettoyés et l’imagerie par microscopie confocale à balayage laser (CLSM) des tissus nettoyés. Notre protocole se concentre sur l’interrogation des structures neuronales des circuits aux échelles des composants subcellulaires. Pour une procédure détaillée de préparation des solutions et d’injection stéréotaxique de vecteurs du virus adéno-associé (AAV) dans le cerveau des souris, se référer à Miyawaki et al. 20167 et Okamoto et al. 20218, respectivement.
Protocol
Representative Results
Discussion
Étapes critiques du protocole
Il y a quelques étapes critiques dans le protocole qui doivent être menées avec la plus grande prudence pour obtenir des résultats significatifs. La fixation uniforme des échantillons est impérative pour l’imagerie 3D dans les tissus à grande échelle. La lentille de l’objectif, l’échantillon et le fluide d’immersion doivent avoir une IR correspondante. L’inadéquation de l’IR entre eux conduira à une imagerie très perturbée des cellules exprimant …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Yoko Ishida (Université Juntendo) pour la production de vecteurs AAV et Kisara Hoshino (Université Juntendo) pour l’assistance technique. Cette étude a été soutenue par JSPS KAKENHI (JP20K07231 à K.Y.; JP21H03529 à T.F.; JP20K07743 à M.K.; JP21H02592 à H.H.) et la recherche scientifique sur le domaine innovant « Resonance Bio » (JP18H04743 à H.H.). Cette étude a également été soutenue par l’Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (AMED) (JP21dm0207112 à T.F. et H.H.), Moonshot R&D de l’Agence japonaise de la science et de la technologie (JST) (JPMJMS2024 à H.H.), Fusion Oriented Research for disruptive Science and Technology (FOREST) de JST (JPMJFR204D à H.H.), Subventions d’aide de l’Institut de recherche sur les maladies de la vieillesse de la Faculté de médecine de l’Université Juntendo (X2016 à K.Y.; X2001 à H.H.), et le projet de marque des écoles privées.
Materials
| 16x multi-immersion objective lens | Leica Microsystems | HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR | |
| Agar | Nacalai Tesque | 01028-85 | |
| Agarose | TaKaRa Bio | L03 | |
| Dimethyl sulfoxide | Nacalai Tesque | 13407-45 | |
| D-Sorbitol | Nacalai Tesque | 06286-55 | |
| γ-cyclodextrin | Wako Pure Chemical Industries | 037-10643 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Huygens Essential | Scientific Volume Imaging | ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b | |
| Imaris | Bitplane | ver. 9.0.0 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | LAS X, ver. 3.5.5.19976 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo Chemical Industry | M1356 | |
| Paraformaldehyde | Merck Millipore | 1.04005.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4) | Nacalai Tesque | 27575-31 | 10x PBS(–) |
| Sodium azide | Nacalai Tesque | 31233-55 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | N/A | |
| TCS SP8 | Leica Microsystems | N/A | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Urea | Nacalai Tesque | 35940-65 | |
| Vibrating tissue slicer | Dosaka EM | PRO7N |
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