Det nuvarande protokollet beskriver genereringen av Drosophila melanogaster som uttrycker eNpHR2.0 eller ReaChR-opsiner i hjärtat för OCT-avbildning och optogenetisk hjärtpacing. Detaljerade instruktioner för Drosophila OCT-avbildning och hjärtslagsmodulering, inklusive simulering av återställbar hjärtstillestånd, bradykardi och takykardi hos levande djur i olika utvecklingsstadier, rapporteras.
Att använda Drosophila melanogaster (bananfluga) som modellorganism har säkerställt betydande framsteg inom många områden av biologisk vetenskap, från cellulär organisation och genomiska undersökningar till beteendestudier. På grund av den ackumulerade vetenskapliga kunskapen har Drosophila under de senaste åren förts till området för modellering av mänskliga sjukdomar, inklusive hjärtsjukdomar. Det presenterade arbetet beskriver det experimentella systemet för övervakning och manipulering av hjärtfunktionen i samband med en hel levande organism med rött ljus (617 nm) och utan invasiva procedurer. Kontroll över hjärtat uppnåddes med hjälp av optogenetiska verktyg. Optogenetik kombinerar uttrycket av ljuskänsliga transgena opsiner och deras optiska aktivering för att reglera den biologiska vävnaden av intresse. I detta arbete användes ett anpassat integrerat optiskt koherenstomografi (OCT) avbildnings- och optogenetiskt stimuleringssystem för att visualisera och modulera det fungerande D. melanogasterhjärtat vid 3: e instarlarven och tidiga pupalutvecklingsstadier. UAS/GAL4 dubbla genetiska systemet användes för att uttrycka halorhodopsin (eNpHR2.0) och rödförskjutet channelrhodopsin (ReaChR), specifikt i flughjärtat. Detaljer om beredning av D. melanogaster för levande OCT-avbildning och optogenetisk pacing tillhandahålls. En laboratorieutvecklad integrationsprogramvara bearbetade bilddata för att skapa visuella presentationer och kvantitativa egenskaper hos Drosophilas hjärtfunktion. Resultaten visar möjligheten att initiera hjärtstillestånd och bradykardi orsakad av eNpHR2.0-aktivering och utföra hjärtpacing vid ReaChR-aktivering.
I slutet av 2010 valde tidskriften Nature Methods optogenetik som årets metod1. Genom att använda genetiska verktyg (transgena opsiner) som regleras av ljus för att kontrollera biologiska vävnader av intresse med oöverträffad precision och hastighet öppnades en översvämningsport för nya applikationer. Hittills hör majoriteten av prestationerna till neurovetenskap. Tekniken introducerades som en ny metod för exakt kontroll av enskilda neuroner2 och har avancerat till upptäckter inom området levande organismkognitiv funktion3. Från början visade neuroforskare förmågan att modulera hela organismens beteende. Uttryck och ljusaktivering av ChR2-opsin hos möss dopaminerga neuroner orsakade deras aktivering och var tillräckliga för att driva beteendekonditionering4. Optogenetisk hämning av en delmängd av neuroner innehållande halorhodopsin NpHR2.0 levererad till det epileptiska fokuset i gnagarhjärnan resulterade i dämpning av elektroencefalografiska anfall5.
Optogenetiska tillämpningar inom kardiologi utvecklas i stadig takt6. ChR2 uttrycktes framgångsrikt i kardiomyocyter cellodling och hos möss; hjärtpacing utfördes genom blixtar av blått ljus (utfört med användning av en implanterad fiber i levande djur)7. I zebrafisk uttrycktes ChR2 och användes för att identifiera den taktskapande hjärtregionen; NpHR-aktivering inducerad hjärtstopp8. Optogenetisk hjärtpacing har den unika potentialen för att utveckla nya pacing- och omsynkroniseringsterapier9. Försök att etablera ett autogent arytmiavslutningssystem har också rapporterats nyligen10.
Omfattande forskning och utveckling av nya terapeutiska behandlingar kräver tillämpning av olika modellsystem, från cellodling till däggdjur. Ett ryggradsdjurs hjärta är ett mycket komplext organ. Kardiomyocyter (CM) utgör en tredjedel av alla hjärtceller; Andra celler inkluderar neuroner, vaskulära glattmuskelceller och icke-exciterbara celler (dvs endotelceller, fibroblaster och immunceller). Forskning om CM-cellodling begränsar översättningen av de erhållna resultaten till humana medicinska tillämpningar. Däggdjursmodellorganismers genetiska manipulationer är begränsade och tidskrävande. Mindre ryggradslösa modeller har många fördelar; Deras kardiovaskulära system bär alla väsentliga histologiska element. Drosophila melanogaster (bananfluga) är ett enkelt och kraftfullt genetiskt modellsystem för att undersöka rollen av gener associerade med mänskliga sjukdomar, inklusive hjärtsjukdomar11,12,13. Som kortlivade djur utgör bananflugor ett utmärkt tillfälle att modellera ålders- eller sjukdomsberoende hjärtfunktionsförändringar som kan spåras under hela livet14,15,16,17. Bananflugans hjärtrör är beläget på kroppens dorsala sida inom 200 μm från nagelbandsytan, vilket gör att synligt för nära infrarött ljus kan nå hjärtröret. Denna anatomiska funktion möjliggör icke-invasiv optisk pacing av Drosophila-hjärtat med hjälp av befintliga optogenetiska verktyg.
För att övervaka Drosophila-hjärtat utvecklades ett anpassat spektraldomän optisk koherenstomografi (SD-OCT) bildsystem med en integrerad LED-excitationsmodul för rött ljus18. Morfologiska och rytmiska förändringar i ett relativt enkelt fruktflugehjärta kan lätt analyseras med denna icke-invasiva biomedicinska bildteknik 12,19,20,21. Med förbättrad optisk sektionsprestanda och rumslig upplösning i mikronskala har OCT framgångsrikt använts för att undersöka strukturen och övervaka Drosophila-hjärtats funktion i olika utvecklingsstadier, inklusive den 3: e instarlarven och tidig puppa18. Detta system möjliggör också samtidig övervakning och stimulering av Drosophilas hjärttillstånd i det intakta djuret. En schematisk vy av ULT-systemet visas i figur 1. SD-OCT-systemet använder en superluminescerande diod (SLD) som ljuskälla (mittvåglängd: 850 nm ± 10 nm, FWHM: 165 nm, se materialtabell). Med hjälp av en 10x objektivlins kan OCT-bildsystemet uppnå en axiell upplösning på ~ 4,4 μm i luft och ~ 3,3 μm i vävnad och en lateral upplösning på ~ 2,8 μm, tillräckligt för att lösa fina detaljer i flyghjärtstrukturerna18,22. Interferenssignaler från reflekterat ljus från referensarmen och provarmen detekteras med hjälp av en spektrometer med en 2048-pixels linjeskanningskamera (max linjehastighet: 80 kHz, se materialförteckning). Den uppmätta systemkänsligheten är ~95,1 dB. Varje OCT-skanning i B-läge genererar en tvärsnittsbild i xz-bildplanet. Upprepade B-lägesbilder förvärvas på samma plats för att skapa M-lägesbilder som fångar det bultande hjärtat i över ~ 30 s 18,22,23. Bildfrekvensen för M-lägesavbildning är ~ 125 bilder / s, tillräckligt för att fånga bananflugans hjärtslagsdynamik.
För den optogenetiska regleringen av Drosophila-hjärtfunktionen , en belysningsmodul med en 617 nm LED-ljuskälla är integrerad med provarmen i SD-OCT-systemet. Stimuleringsljuset är fokuserat på en ~ 2.2 mm diameter fläck på provytan, i samma position som bildfokuspunkten. En specialskriven programvara används för att styra belysningsläget (ljusintensitet, pulsbredd och arbetscykel), justera ljuspulsstimuleringsfrekvensen och synkronisera LED-modulbelysningen och M-läge OCT-bildförvärv22.
Nya publikationer beskrev Drosophila transgena system bestående av spatiotemporalt reglerade ChR2, ReaChR och eNpHR2.0 opsiner med hjälp av UAS / GAL4 genetiska systemet. De erhållna resultaten har visat förmågan att initiera hjärtstillestånd och bradykardi orsakad av aktivering av rött ljus av eNpHR2.0 och högre frekvens hjärtpacing orsakad av aktivering av blått ljus av ChR2. Liknande pacing-experiment utfördes med en annan channelrhodopsin, ReaChR, inducerbar genom rödljusbelysning22,23,24. Opsinuttrycket i alla de beskrivna experimenten drevs av 24B-GAL4, där opsinuttryck observerades i ett brett spektrum av vävnader, inklusive kardiomyocyter och omgivande muskelceller. I den aktuella studien ersattes 24B-GAL4 av en Hand-GAL4-drivrutin för att uppnå hjärtspecifikt eNpHR2.0- och ReaChR-opsinuttryck.
Sammantaget visar de presenterade experimentella resultaten återställbar hjärtstillestånd och inducerbar bradykardi och takykardi hjärtsjukdomar. Ett detaljerat protokoll med steg-för-steg-instruktioner för att skapa transgena Drosophila-modeller och genomföra samtidig OCT-avbildning och optogenetiska pacing-experiment i levande djur tillhandahålls.
Jämfört med våra tidigare rapporter där uttrycket av opsiner drevs inte bara i hjärtat utan också i de omgivande muskelvävnaderna, rapporterar det nuvarande arbetet med hjälp av en hjärtspecifik drivrutin, Hand-GAL4. Denna nya Hand> opsin genetiska konfiguration som används för optogenetisk hjärtreglering bekräftar ytterligare tidigare rapporterade resultat och etablerar en bättre Drosophila kardiovaskulär forskningsmodell.
Medieförberedelser är avgörande för att experimenten ska lyckas. Opsinproteiner kräver en ligand, all-trans retinal (ATR), för att fungera28. Flugor producerar inte tillräckligt med ATR, så ATR måste kompletteras med flugmedia. I denna studie ersattes den tidigare rapporterade snabbmaten med Semi-Defined media29. Det nya receptet på ATR-innehållande media introducerades för att säkerställa en enhetlig fördelning av ATR. ATR är inte lösligt i vatten; När etanolbaserad 100 mM ATR-stam tillsätts till vattenbaserade medier sprids den genom virvelbildning av injektionsflaskorna som innehåller varma halvdefinierade medier. Dessutom sänktes den tidigare rapporterade ATR-koncentrationen från 10 mM för eNpHR2,0 och 3 mM för ReaChR22 till en slutlig koncentration på 1 mM för båda. Denna koncentration är tillräcklig för att säkerställa korrekt eNpHR2.0 och ReaChR-funktion.
En viktig del av den experimentella framgången är den förbättrade databehandlingen med FlyNet 2.027. Laboratoriet har fortsatt att utveckla denna programvara för att förbättra både beräkningseffektiviteten och noggrannheten hos den automatiserade flughjärtsegmenteringsalgoritmen. Tvärsnittsmaskerna som produceras av denna programvara används för att härleda Drosophila fysiologiska data såsom fraktionerad förkortning och hjärtväggshastighet. Detta tillvägagångssätt har möjliggjort effektiv dataanalys med minimal mänsklig övervakning, vilket gör det snabbare och mer tillförlitligt att karakterisera hjärtfunktionen för stora flyghjärtavbildningsdataset.
Hjärtinfarkt är fortfarande den främsta dödsorsaken, och myokardiell ischemi bidrar till två tredjedelar av alla fall av hjärtsvikt, som snabbt växer fram bland de främsta orsakerna till dödlighet och sjuklighet i USA30. Utvecklingen av nya terapier och medicintekniska produkter kräver djup kunskap om mekanismerna för hjärtsjukdomar på fysiologiska och biokemiska nivåer. Dessa mål kan uppnås med hjälp av modellorganismer. D. melanogaster har etablerat sig som en av de mest pålitliga och effektiva modellerna 31,32,33,34,35. Detta arbete har genererat de simulerade Drosophila-hjärtsjukdomarsmodellerna inducerade av ett icke-invasivt optogenetiskt tillvägagångssätt. Utvecklingen av icke-invasiv optisk hjärtpacingteknik ger en grund för att utveckla ett alternativ till traditionella elektriska hjärtpacing-enheter. Genom att använda OCT för att observera hjärtfunktionen i realtid kan studier exakt karakterisera relevant hjärtfysiologi i Drosophila-modeller för avancerade undersökningar, inklusive screening av läkemedelskandidater. OCT-avbildning har ett penetrationsdjup på ~ 1 mm, vilket fungerar bra för Drosophila-hjärtstudier men begränsar dess användning för att karakterisera hjärtfunktionen i större djurmodeller. Dessutom är det en utmaning att direkt översätta Drosophila-forskning till däggdjursmodeller. Nya optogenetiska verktyg måste utvecklas för att förbättra opsinernas känslighet och översätta dem till olika modellsystem, inklusive zebrafiskar, möss, råttor och mänskliga hjärtorganoider, för kardiovaskulär forskning.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Andrey Komarov, Yuxuan Wang och Jiantao Zhu för deras hjälp med dataanalys och tackar Zhou-labbmedlemmarna för deras värdefulla diskussioner. Arbetet i Dr. Zhous laboratorium stöddes av en startfond från Washington University i St. Louis, National Institutes of Health (NIH) beviljar R01-EB025209 och R01-HL156265 och Clayco Foundation Innovative Research Award.
All-trans retinal | Cayman Chemicals | 18449 | |
Bacto Peptone | Gibco | 02-10-2025 | |
BioLED Light Source Control Module, 4-channel | Migtex Systems | BLS-SA04-US | Part of the optogenetic stimulation module |
Broadband Light Source Module | Superlum | cBLMD-T-850-HP | Part of the SD-OCT imaging system |
Cobra-S 800 OCT Spectrometers | Wasatch Photonics | CS800-840/180-80-OC2K-U3 | Part of the SD-OCT imaging system |
Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professtional | 34155 | tissues |
Drosophila agar | Genesee Scientific | 66-103 | |
Drosophila culture bottles | Genesee Scientific | 32-131 | |
FlyNet 2.0 Software | Z-Lab | Custom software for fly heart segmentation and heart function analysis developed in the Zhou lab | |
High-Power LED Collimator Sources | Migtex Systems | BLS-LCS-0617-03-22 | Part of the optogenetic stimulation module |
Inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-106 | |
Microscope slides | AmScope | BS-72P | |
Narrow plugs for Drosophila culture | Genesee Scientific | 59-200 | |
Narrow vials for Drosophila culture | Genesee Scientific | 32-116SB | |
Permanent double-sided tape | Scotch | ||
Plugs for Drosophila bottles | Genesee Scientific | 59-194 | |
Propionic Acid | Sigma | P1386-1L | |
SD-OCT control software | Z-Lab | Custom software for image acquisition and pacing control developed in the Zhou lab | |
SD-OCT imaging and optogenetic pacing system | Z-Lab | Imaging and optogenetic pacing system developed in the Zhou lab (~$50k BOM) | |
Sucrose | Carolina | 89-2871 | |
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 41752 | eNpHR2.0 transgenic line |
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 53748 | ReaChR transgenic line |
w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 48396 | Heart specific GAL4 driver containing Hand gene regulatory fragment |
y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock #6658 | GFP reporter line |
Yeast extract | Lab Scientific bioKEMIX | 978-907-4243 |