JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
自动翻译
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物工程

Utveckla Drosophila melanogaster-modeller för avbildning och optogenetisk kontroll av hjärtfunktionen

Published: August 25, 2022
doi:
10.3791/63939
, , , , ,
1Department of Biomedical Engineering,Washington University in St. Louis, 2Department of Computer Science and Engineering,Washington University in St. Louis

Summary

Det nuvarande protokollet beskriver genereringen av Drosophila melanogaster som uttrycker eNpHR2.0 eller ReaChR-opsiner i hjärtat för OCT-avbildning och optogenetisk hjärtpacing. Detaljerade instruktioner för Drosophila OCT-avbildning och hjärtslagsmodulering, inklusive simulering av återställbar hjärtstillestånd, bradykardi och takykardi hos levande djur i olika utvecklingsstadier, rapporteras.

Abstract

Att använda Drosophila melanogaster (bananfluga) som modellorganism har säkerställt betydande framsteg inom många områden av biologisk vetenskap, från cellulär organisation och genomiska undersökningar till beteendestudier. På grund av den ackumulerade vetenskapliga kunskapen har Drosophila under de senaste åren förts till området för modellering av mänskliga sjukdomar, inklusive hjärtsjukdomar. Det presenterade arbetet beskriver det experimentella systemet för övervakning och manipulering av hjärtfunktionen i samband med en hel levande organism med rött ljus (617 nm) och utan invasiva procedurer. Kontroll över hjärtat uppnåddes med hjälp av optogenetiska verktyg. Optogenetik kombinerar uttrycket av ljuskänsliga transgena opsiner och deras optiska aktivering för att reglera den biologiska vävnaden av intresse. I detta arbete användes ett anpassat integrerat optiskt koherenstomografi (OCT) avbildnings- och optogenetiskt stimuleringssystem för att visualisera och modulera det fungerande D. melanogasterhjärtat vid 3: e instarlarven och tidiga pupalutvecklingsstadier. UAS/GAL4 dubbla genetiska systemet användes för att uttrycka halorhodopsin (eNpHR2.0) och rödförskjutet channelrhodopsin (ReaChR), specifikt i flughjärtat. Detaljer om beredning av D. melanogaster för levande OCT-avbildning och optogenetisk pacing tillhandahålls. En laboratorieutvecklad integrationsprogramvara bearbetade bilddata för att skapa visuella presentationer och kvantitativa egenskaper hos Drosophilas hjärtfunktion. Resultaten visar möjligheten att initiera hjärtstillestånd och bradykardi orsakad av eNpHR2.0-aktivering och utföra hjärtpacing vid ReaChR-aktivering.

Introduction

I slutet av 2010 valde tidskriften Nature Methods optogenetik som årets metod1. Genom att använda genetiska verktyg (transgena opsiner) som regleras av ljus för att kontrollera biologiska vävnader av intresse med oöverträffad precision och hastighet öppnades en översvämningsport för nya applikationer. Hittills hör majoriteten av prestationerna till neurovetenskap. Tekniken introducerades som en ny metod för exakt kontroll av enskilda neuroner2 och har avancerat till upptäckter inom området levande organismkognitiv funktion3. Från början visade neuroforskare förmågan att modulera hela organismens beteende. Uttryck och ljusaktivering av ChR2-opsin hos möss dopaminerga neuroner orsakade deras aktivering och var tillräckliga för att driva beteendekonditionering4. Optogenetisk hämning av en delmängd av neuroner innehållande halorhodopsin NpHR2.0 levererad till det epileptiska fokuset i gnagarhjärnan resulterade i dämpning av elektroencefalografiska anfall5.

Optogenetiska tillämpningar inom kardiologi utvecklas i stadig takt6. ChR2 uttrycktes framgångsrikt i kardiomyocyter cellodling och hos möss; hjärtpacing utfördes genom blixtar av blått ljus (utfört med användning av en implanterad fiber i levande djur)7. I zebrafisk uttrycktes ChR2 och användes för att identifiera den taktskapande hjärtregionen; NpHR-aktivering inducerad hjärtstopp8. Optogenetisk hjärtpacing har den unika potentialen för att utveckla nya pacing- och omsynkroniseringsterapier9. Försök att etablera ett autogent arytmiavslutningssystem har också rapporterats nyligen10.

Omfattande forskning och utveckling av nya terapeutiska behandlingar kräver tillämpning av olika modellsystem, från cellodling till däggdjur. Ett ryggradsdjurs hjärta är ett mycket komplext organ. Kardiomyocyter (CM) utgör en tredjedel av alla hjärtceller; Andra celler inkluderar neuroner, vaskulära glattmuskelceller och icke-exciterbara celler (dvs endotelceller, fibroblaster och immunceller). Forskning om CM-cellodling begränsar översättningen av de erhållna resultaten till humana medicinska tillämpningar. Däggdjursmodellorganismers genetiska manipulationer är begränsade och tidskrävande. Mindre ryggradslösa modeller har många fördelar; Deras kardiovaskulära system bär alla väsentliga histologiska element. Drosophila melanogaster (bananfluga) är ett enkelt och kraftfullt genetiskt modellsystem för att undersöka rollen av gener associerade med mänskliga sjukdomar, inklusive hjärtsjukdomar11,12,13. Som kortlivade djur utgör bananflugor ett utmärkt tillfälle att modellera ålders- eller sjukdomsberoende hjärtfunktionsförändringar som kan spåras under hela livet14,15,16,17. Bananflugans hjärtrör är beläget på kroppens dorsala sida inom 200 μm från nagelbandsytan, vilket gör att synligt för nära infrarött ljus kan nå hjärtröret. Denna anatomiska funktion möjliggör icke-invasiv optisk pacing av Drosophila-hjärtat med hjälp av befintliga optogenetiska verktyg.

För att övervaka Drosophila-hjärtat utvecklades ett anpassat spektraldomän optisk koherenstomografi (SD-OCT) bildsystem med en integrerad LED-excitationsmodul för rött ljus18. Morfologiska och rytmiska förändringar i ett relativt enkelt fruktflugehjärta kan lätt analyseras med denna icke-invasiva biomedicinska bildteknik 12,19,20,21. Med förbättrad optisk sektionsprestanda och rumslig upplösning i mikronskala har OCT framgångsrikt använts för att undersöka strukturen och övervaka Drosophila-hjärtats funktion i olika utvecklingsstadier, inklusive den 3: e instarlarven och tidig puppa18. Detta system möjliggör också samtidig övervakning och stimulering av Drosophilas hjärttillstånd i det intakta djuret. En schematisk vy av ULT-systemet visas i figur 1. SD-OCT-systemet använder en superluminescerande diod (SLD) som ljuskälla (mittvåglängd: 850 nm ± 10 nm, FWHM: 165 nm, se materialtabell). Med hjälp av en 10x objektivlins kan OCT-bildsystemet uppnå en axiell upplösning på ~ 4,4 μm i luft och ~ 3,3 μm i vävnad och en lateral upplösning på ~ 2,8 μm, tillräckligt för att lösa fina detaljer i flyghjärtstrukturerna18,22. Interferenssignaler från reflekterat ljus från referensarmen och provarmen detekteras med hjälp av en spektrometer med en 2048-pixels linjeskanningskamera (max linjehastighet: 80 kHz, se materialförteckning). Den uppmätta systemkänsligheten är ~95,1 dB. Varje OCT-skanning i B-läge genererar en tvärsnittsbild i xz-bildplanet. Upprepade B-lägesbilder förvärvas på samma plats för att skapa M-lägesbilder som fångar det bultande hjärtat i över ~ 30 s 18,22,23. Bildfrekvensen för M-lägesavbildning är ~ 125 bilder / s, tillräckligt för att fånga bananflugans hjärtslagsdynamik.

För den optogenetiska regleringen av Drosophila-hjärtfunktionen , en belysningsmodul med en 617 nm LED-ljuskälla är integrerad med provarmen i SD-OCT-systemet. Stimuleringsljuset är fokuserat på en ~ 2.2 mm diameter fläck på provytan, i samma position som bildfokuspunkten. En specialskriven programvara används för att styra belysningsläget (ljusintensitet, pulsbredd och arbetscykel), justera ljuspulsstimuleringsfrekvensen och synkronisera LED-modulbelysningen och M-läge OCT-bildförvärv22.

Nya publikationer beskrev Drosophila transgena system bestående av spatiotemporalt reglerade ChR2, ReaChR och eNpHR2.0 opsiner med hjälp av UAS / GAL4 genetiska systemet. De erhållna resultaten har visat förmågan att initiera hjärtstillestånd och bradykardi orsakad av aktivering av rött ljus av eNpHR2.0 och högre frekvens hjärtpacing orsakad av aktivering av blått ljus av ChR2. Liknande pacing-experiment utfördes med en annan channelrhodopsin, ReaChR, inducerbar genom rödljusbelysning22,23,24. Opsinuttrycket i alla de beskrivna experimenten drevs av 24B-GAL4, där opsinuttryck observerades i ett brett spektrum av vävnader, inklusive kardiomyocyter och omgivande muskelceller. I den aktuella studien ersattes 24B-GAL4 av en Hand-GAL4-drivrutin för att uppnå hjärtspecifikt eNpHR2.0- och ReaChR-opsinuttryck.

Sammantaget visar de presenterade experimentella resultaten återställbar hjärtstillestånd och inducerbar bradykardi och takykardi hjärtsjukdomar. Ett detaljerat protokoll med steg-för-steg-instruktioner för att skapa transgena Drosophila-modeller och genomföra samtidig OCT-avbildning och optogenetiska pacing-experiment i levande djur tillhandahålls.

Protocol

För denna studie, eNpHR2.0 transgen linje w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2, ReaChR transgen linje w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO, och hjärtspecifik GAL4-drivrutin som innehåller handgenreglerande fragment w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] (detta drivrutinslager kommer att anges som Hand-GAL4) användes. y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 användes som GFP-reporterlinje. De nämnda Drosophila-lagren erhölls från Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC, se materialförteckning) och hölls vid rumstemperatur eller vid 18 °C på vanliga majsmjölsmedier. Drosophila-modellerna som utvecklats i denna studie är tillgängliga på begäran för samarbete. 1. Drosophila genetiska kors och medieberedning Ändra den 3: e kromosombalanseraren TM3 Sb [1] till TM6 Sb Tb, skapa w [1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM6 Sb Tb (Hand-GAL4/TM6 Sb Tb). Se kompletterande figur 1 för korsningssystemet. Ställ kors i ampuller med vanliga majsmjölsmedier.OBS: Närvaron av en Tb-markör gör det möjligt för användare att skilja larver och puppor som innehåller opsintransgen och GAL4-drivrutinen från djur som innehåller opsin men ingen drivrutin25. Förvara de genetiska korsen i en 25 ° C, 70% fuktighetsinkubator på speciellt formulerade all-trans retinaI (ATR) -innehållande media (se materialtabell) i mörkret i 5 dagar för larvsamling och 6 dagar för puppsamling. Kombinera fem Hand-GAL4 /TM6 Sb Tb jungfruliga honor och två till tre hanar från UAS-opsin-bestånd (eNpHR2.0 eller ReaChR) per injektionsflaska. Se korsdiagrammet för eNpHR2.0 och ReaChR opsin i figur 2A respektive figur 2B. På nästa dag, förbered ATR-innehållande mediaflaskor.Förbered halvdefinierad mat enligt instruktionerna i BDSC26. Istället för sackaros och glukos, tillsätt endast sackaros (5,14 g/100 ml). Kyl till ~60 °C under konstant omrörning. Förbered smala flugflaskor och tillsätt 50 μl 100 mM ATR-etanollösning till varje injektionsflaska. Använd en serologisk pipett och kassera flugmat till smala flugflaskor, 5 ml per injektionsflaska. Vortex vid maximal hastighet i 10 s. Anslut injektionsflaskorna och linda in dem i det mörka tyget för att skydda dem från ljus. Låt injektionsflaskorna torka i minst 12 timmar (över natten). Nästa dag, överför flugorna stadigt lägger ägg från steg 1.3. till injektionsflaskorna med ATR-innehållande livsmedel (steg 1.4.4). Skydda ställen med ampuller från ljus. Efter 24-48 h (beroende på antalet ägg som läggs), kassera föräldrarna för att förhindra överbefolkning av injektionsflaskan. Samla icke-Tb-avkomma och använd dem för hjärtavbildning.OBS: De fenotypiska skillnaderna vid larv- och valpstadierna demonstreras i figur 2C. Sammanfattningen och den ungefärliga tidslinjen för provberedningsstegen visas i figur 3. 2. Optogenetisk kontroll av Drosophila-hjärtat Välj UAS-opsin/Hand-GAL4 larv/ puppa från injektionsflaskan (steg 1.7), sätt på vävnad och torka försiktigt av mediet från kroppsytan med en målarborste. Förbered mikroskopbilden och placera en liten bit dubbelsidig tejp i mitten. Använd en borste eller finpincett och placera försiktigt larven/puppan på tejpytan med ryggsidan uppåt och vinkelrätt mot bildens långsida. Tryck försiktigt för att fästa larven/poppen på tejpytan. Sätt upp rutschkanan på bildstadiet, larv/puppa nedåt. Slå på OCT-ljuskällan med laserkontrollprogramvara (se Materialförteckning). Öppna den specialskrivna SD-OCT-kontrollprogramvaran och klicka sedan på förhandsgranskningsfönstret . Ställ in skanningsparametrarna i SD-OCT-programvaran.OBS: Målet är att justera provet för optimal avbildning av det bultande hjärtat, så att välja X-intervall och Y-intervall täcker hjärtats region. I det här steget är både antalet A-skanningar och B-skanningar 400. Intervallet i x- och y-riktningarna är ~490 μm och ~537 μm, vilket visar hjärtats två ortogonala tvärsnitt (xz respektive yz). Använd mikromanipulatorer för att styra provsteget för att få flughjärtat i fokus. Justera brännvidden för att minimera ljusreflektion från flugans nagelbandsyta. Överväg att applicera mineralolja på larv/puppaytan för att minimera reflektion.OBS: Olja kan öka risken för djurrörelser genom att kompromissa med tejpens vidhäftande egenskaper. Se till att flyghjärtat kan ses fullt ut i bildfönstret utan några snedvridningar, blockeras av vävnad och icke-försumbara skuggor och reflektioner; annars går du tillbaka till steg 2.7. Ställ in skanningsparametrarna för OCT-bildförvärv i M-läge.OBS: Antalet A-skanningar minskas jämfört med steg 2.7. för den snabbare bildfrekvensen för att fånga flyghjärtats slagdynamik (flera Hz). Antalet B-skanningar anger antalet upprepade bildrutor för M-lägesavbildning, som kan justeras baserat på inspelningstid och tillgängligt systemminne. I detta experiment kan 128 A-skanningar tillåta en hastighet på ~ 125 ramar / s, och 4,000 upprepade B-skanningar spelas in, vilket ger en kontinuerlig inspelning på ~ 32 s. Skaffa fem uppsättningar kontrolldata utan röda ljusstimuleringspulser för att beräkna vilopulsen (RHR). Designa ljuspulsen för tempostimulering i den anpassade OCT-kontrollprogramvaran. I “Inställningar” lägger du till de designade ljuspulssekvenserna för att styra pulsfrekvens, pulsbredd, stimuleringstid och väntetid enligt olika stimuleringsprotokoll.OBS: RHR mäts från kontrollexperimentet utan ljusbelysning och används för att beräkna frekvensen vid vilken ljus ska pulseras för takypacing och bradypacing-experiment22. Öppna programvaran för ljusstyrenhet (se materialförteckning) för att generera pulser för rött ljus. Välj pulsläge i “Lägesval”. Dubbelklicka på figuren för inställningarna för “Pulsprofil” och välj Följarläge. Håll OFF-intensiteten som 0 och ställ in ON-intensitetsprocenten när du beräknar den faktiska effekttätheten.OBS: Stimuleringsljuspulser utlöses av en signal från OCT-styrprogramvaran enligt inställningarna i steg 2.12. Skaffa M-mode-videor av det slående Drosophila-hjärtat med ljusstimulering genom att klicka på Acquire i OCT-kontrollprogramvaran. Upprepa mätningarna 5x. 3. Bildanalys Öppna den specialutvecklade programvaran för segmentering av flyghjärtan. Klicka på Välj fil och välj sedan filen som ska analyseras i GUI som visas. Ange både de lodräta och vågräta gränserna för hjärtregionen i pixlar i de översta textrutorna. Klicka på Ändra storlek. Använd skjutreglaget på botten och se till att hela hjärtregionen är synlig och att den fyller upp hela lådan för hela samlingen. Om det inte är det, upprepa denna process och justera gränserna. Klicka på Förutsäga för att förutsäga hjärtregionen. Programmet kommer nu att gå igenom varje skiva i samlingen och välja hjärtregion, vilket tar cirka 3 minuter. Klicka på HR Plot när förutsägelsen är klar. Detta öppnar ett nytt fönster som visar en tomt i hjärtområdet över tiden. Se till att rätt topp- eller dalområden väljs. Välj Puls och sedan HR för att generera en slutlig siffra, och de funktionella parametrarna sparas i de .csv filerna samtidigt.

Representative Results

D. melanogasterdjur som uttrycker röda ljuskänsliga opsiner eNpHR2.0 eller ReaChR i hjärtröret genererades genom att erhålla avkomma från korsningen mellan varje UAS-opsin transgen linje och Hand-GAL4-drivrutin . Vävnadsspecificiteten hos GAL4-drivrutinen verifierades genom avbildning av GFP-uttryck (figur 4). Drosophila 3rd instar larva och tidiga puppa utvecklingsstadier användes för att visa effekterna av eNpHR2.0 och ReaChR aktivering med rött ljus. Designade ~617 nm rödljuspulser, levererade av LED, belyste larven/poppen och aktiverade eNpHR2.0 och ReaChR i hjärtat. Även om den rapporterade maximala svarsvåglängden för NpHR är ~ 580 nm och för ReaChR är ~ 600 nm, kan 617 nm ljusbelysning tränga djupare med förbättrad ljusenergileverans mot den opsinuttryckande hjärtvävnaden22. Monterad på mikroskopbilden med ryggsidan nedåt i den inverterade mikroskopinställningen, belystes larven / poppen av en LED-ljusstråle riktad mot A7-kroppssegmentet. Exempel på kroppstvärsnittsbilder visas i figur 5A och figur 6A. Hjärtat framträder som en sammandragande och vidgande cirkulär form i videoinspelningarna som består av 4 000 bilder (kompletterande videor 1-6). För att efterlikna olika hjärtsjukdomar designades fyra typer av ljuspulser. En enda puls som varade 10 s efter 5 s väntetid genererade återställbart hjärtstopp inducerat av eNpHR2.0, som visas i figur 5B. För hjärtfrekvensen vid frekvenser som är långsammare än vilopulsen (RHR), medierad av eNpHR2.0, användes två ljuspulssekvenser med pacingfrekvenser lika med RHR/2 och RHR/4 som varade i 8 s med en väntetid på 6 s däremellan (figur 5C). Arbetscykeln för varje ljuspulssekvens var 90%. Denna ljusstimuleringsregim orsakade ett hjärtsjukdom som påminner om bradykardi. Stimuleringsmönstret för att öka hjärtfrekvensen på grund av ReaChR-aktivering bestod av tre sekvenser av ljuspulser vid frekvenser av RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz respektive RHR + 1,5 Hz med en pulsbredd på 20 ms (Figur 5D). Denna pulsregim syftade till att orsaka ett takykardiskt hjärtsjukdom. Ljuseffekten var 7,49 mW/mm2 under alla experiment. För kontrollexperiment ställdes ingen ljusbelysning in. Varje experimentell variant registrerades fem gånger. M-mode-videor av flughjärtat bearbetades till 2D-masker med FlyNet 2.027. Denna programvara segmenterar automatiskt hjärtregionen för att producera hjärtfunktionsdatauppsättningarna. Programmet ger en mask av hjärtat i varje ram, som vid behov kan korrigeras ytterligare manuellt för att generera exakt kvantifiering av det bultande hjärtats funktionella parametrar, såsom hjärtfrekvens (HR), slutdiastolisk dimension (EDD) och slutsystolisk dimension (ESD), fraktionerad förkortning (FR), slutdiastoliskt område (EDA), slutsystoliskt område (ESA), etc. Hjärtfrekvensen mäts genom att analysera hjärtområdet över tid. Kontrollvideon utan ljuspulser används för att fastställa en baslinjepuls (t.ex. RHR) för varje djur. Figur 5B och figur 6B visar 10 s långt hjärtstopp orsakat av Hand>eNpHR2.0-aktivering med rött ljus (617 nm) i larv respektive puppa. När det röda ljuset tändes slutade Drosophilas hjärta att slå och förblev i detta tillstånd fram till slutet av ljusbelysningen. Hjärtfunktionen återställdes efter att det röda ljuset släcktes. Djur som inte hade opsin uttryckt (“no opsin”-kontroll) svarade inte på rödljusbelysningen (tilläggsfigur 2A och tilläggsfigur 3A). Kontrollförsöken med hand>eNpHR2.0-djur där 10 s rödljusbelysning inte var påslagen (“inget ljus”-kontroll) visade att hjärtat slog normalt (kompletterande figur 4A och tilläggsfigur 4C). Med hjälp av hand>eNpHR2.0-djur applicerades röda ljuspulser vid frekvenser lägre än RHR. Hjärtkontraktionsfrekvensen minskade efter ljussignalerna; denna långsammare hjärtfrekvens efterliknar en typ av hjärtarytmi, bradykardi (figur 5C och figur 6C för larv respektive puppa). Det långsammare hjärttempot observerades inte i “no opsin” (kompletterande figur 2B och tilläggsfigur 3B) och i kontrollexperiment med “inget ljus” (tilläggsfigur 4A och kompletterande figur 4C). Att öka hjärtfrekvensen kan uppnås genom att aktivera Hand>ReaChR opsin med pulståg med rött ljus med en frekvens som är högre än RHR för det givna djuret. En serie av tre ljuspulståg vid olika stimuleringsfrekvenser (t.ex. RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz, RHR + 1,5 Hz) applicerades på Hand>ReaChRlarver och pupparhjärtan. De erhållna uppgifterna visar tydligt ökad hjärtfrekvens efter ljuspulserna (figur 5D och figur 6D för larv respektive puppa). Hjärtfelet som demonstreras i dessa experiment efterliknar takykardi. Negativa kontrollexperiment visas i tilläggsfigur 2C, tilläggsfigur 3C och tilläggsfigur 4B,D. Sammantaget visar resultaten genomförbarheten av icke-invasiv och specifik optogenetisk kontroll av hjärtrytmen i olika utvecklingsstadier i transgena djurmodeller av D. melanogaster. Figur 1: OCT-bildsystem integrerat med 617 nm LED-modul för optogenetisk kontroll av Drosophila-hjärtfunktionen. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 2: Generera D. melanogaster djur som uttrycker opsin i hjärtat. (A) Genetiskt korsdiagram. Kvinnor Hand-GAL4/TM6 SbTb korsades till hanar som bar eNpHR2.0. Den resulterande Hand-GAL4/eNpHR2.0-avkomman (markerad med den röda stjärnan) samlades in för OCT-avbildning, och Hand-GAL4/TM6 Sb Tb kasserades baserat på deras fenotypiska utseende. (B) Genetiskt korsdiagram. Kvinnor Hand-GAL4 / TM6 SbTb korsades till män som bär ReaChR. Den resulterande Hand-GAL4/ReaChR-avkomman (markerad med den röda stjärnan) samlades in för OCT-avbildning, och Hand-GAL4/TM6 Sb Tb kasserades baserat på deras fenotypiska utseende. (C) Fenotypiska skillnader mellan Hand-GAL4/opsin (röd stjärna) och Hand-GAL4/TM6 Tb avkomma. Djur som bär Tb-genmutationen på TM6-kromosomen har en “tubby” kroppsform jämfört med normal, icke-Tb-larv eller puppa. Den vänstra panelen visar larver; Den högra panelen visar tidiga puppor. Bilderna innehåller också en linjal med 1 mm märken. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 3: Schematisk presentation och tidslinje för bildberedningsprocedurerna. Föräldralager förvaras i flugflaskor; Jungfruliga kvinnor och män korsas i smala ampuller fyllda med vanlig mat (indikeras med gul färg). Aktivt äggläggande flugor överförs till ATR-innehållande media (visas i bruna) ampuller. Injektionsflaskor med utvecklande avkomma måste hållas i mörkret från detta steg. 3: e instar larver och tidig puppa samlas in från injektionsflaskans väggar för avbildning. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 4: D. melanogaster tidig puppa som uttrycker UAS-GFP (BDSC 6658) som drivs av Hand-GAL4 (BDSC 48396). Fluorescensmönstret bekräftar hjärtspecificiteten hos Hand-GAL4-drivrutinen . Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 5: Simulering av hjärtstillestånd, bradykardi och takykardi i D. melanogasterlarv . A) ULT-bild av ett tvärsnitt av larvkroppen. Hjärtat framträder som en cirkel under kroppens yta. (B) Grafisk presentation av det återställbara hjärtstoppet. Den övre panelen visar tidpunkten (X-axeln) för rödljusbelysningen (Y-axeln, ljuskällans effektnivå i procent). Den mellersta panelen indikerar förändringen i hjärtområdet (Y-axel, kvadratmikrometer) över tiden (X-axeln). Den nedre panelen visar hjärtfrekvensförändringen (Y-axeln, hertz) över tid (X-axeln). (C) Grafisk presentation av eNpHR2.0-medierad återställbar bradykardi. Den övre panelen visar pulser av rödljusbelysningen, vilket inducerar två perioder av bradykardi: 50% av RHR och 25% av RHR. Hjärtområde och hjärtfrekvensförändringar visas på mitten respektive nedre panelerna. (D) Grafisk presentation av hjärtpacing med aktiverad ReaChR. Den övre panelen visar en serie av 20 ms röda ljuspulser som uppträder vid RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz och RHR + 1,5 Hz frekvenser. Hjärtkontraktionerna följer ljuspulsfrekvenserna, som visas på de mellersta och nedre panelerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 6: Simulering av hjärtstillestånd, bradykardi och takykardi i D. melanogaster puppa . (A) ULT-bild av pupalkroppstvärsnitt. Hjärtat framträder som en cirkel under kroppens yta. (B) Grafisk presentation av det återställbara hjärtstoppet. Den övre panelen visar tidpunkten (X-axeln) för rödljusbelysningen (Y-axeln, ljuskällans effektnivå i procent). Den mellersta panelen indikerar förändringen i hjärtområdet (Y-axel, kvadratmikrometer) över tiden (X-axeln). Den nedre panelen visar hjärtfrekvensförändringen (Y-axeln, hertz) över tid (X-axeln). (C) Grafisk presentation av eNpHR2.0-medierad återställbar bradykardi. Den övre panelen visar pulser av rödljusbelysningen, vilket inducerar två perioder av bradykardi: 50% av RHR och 25% av RHR. De mellersta och nedre panelerna visar hjärtområde respektive hjärtfrekvensförändringar. (D) Grafisk presentation av hjärtpacing med aktiverad ReaChR. Den övre panelen visar en serie av 20 ms röda ljuspulser vid RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz och RHR + 1,5 Hz frekvenser. Hjärtkontraktionerna följer ljuspulsens frekvenser, som visas på de mellersta och nedre panelerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Kompletterande figur 1: Genetiska korsningar för att ersätta TM3 Sb-balanseringskromosom med TM6 Sb Tb. Virgin honor Hand-GAL4 w +/ TM3 Sb korsades med nub-GAL4NP3537 tub-GAL80ts w +/ TM6 Sb Tb hanar. Hand-GAL4 w +/ TM6 Sb Tb avkomma, inklusive jungfruliga kvinnor och män, valdes (screening för pigmenterade ögon i kombination med tubby kroppsform). Utvalda flugor korsades själv för att skapa ett stabilt lager. Klicka här för att ladda ner den här filen. Kompletterande figur 2: I kontrollexperiment förändras inte vildtypslarvens hjärtrytm vid rödljusbelysning. (A) Inget hjärtstopp observerades under rödljusbelysningen i wt-larven. Den övre panelen visar M-läges hjärtbilder. Den röda linjen indikerar belysningstiden. De mellersta och nedre panelerna visar hjärtområdet och hjärtfrekvensen under 32 s bildtid. (B,C) Röda ljuspulser förändrar inte hjärtfrekvensen i wt larva. De övre panelerna visar M-läge hjärtbilder. Den röda linjen indikerar belysningstiden. De mellersta och nedre panelerna visar hjärtområdet och hjärtfrekvensen under 32 s bildtid. Klicka här för att ladda ner den här filen. Kompletterande figur 3: I kontrollexperiment förändras inte den vilda typen (wt) puppans hjärtrytm vid belysning av rött ljus. (A) Inget hjärtstopp observerades under rödljusbelysningen i wt-larven. Den övre panelen visar M-läges hjärtbilder. Den röda linjen indikerar belysningstiden. De mellersta och nedre panelerna visar hjärtområdet och hjärtfrekvensen under 32 s bildtid. (B,C) Röda ljuspulser ändrar inte hjärtfrekvensen i wt-puppan. De övre panelerna visar M-läge hjärtbilder. Den röda linjen indikerar belysningstiden. De mellersta och nedre panelerna visar hjärtområdet och hjärtfrekvensen under 32 s bildtid. Klicka här för att ladda ner den här filen. Kompletterande figur 4: D. melanogasterlarver och puppor som uttrycker Hand> eNpHR2.0 eller Hand>ReaChR visar inte signifikanta HR-förändringar under OCT-avbildning utan rödljusbelysning. (A) Hjärtfrekvensen hos hand >eNpHR2.0 larv. (B) Hjärtfrekvensen hos Hand>ReaChR-larven . (C) Hjärtfrekvensen för Hand>eNpHR2.0 puppa. (D) Hjärtfrekvensen för Hand>ReaChR puppa. Klicka här för att ladda ner den här filen. Kompletterande video 1: Aktiverad eNpHR2.0 orsakar hjärtstillestånd i D. melanogaster larv. Klicka här för att ladda ner den här videon. Kompletterande video 2: Aktiverad eNpHR2.0 orsakar hjärtstillestånd i D. melanogaster puppa. Klicka här för att ladda ner den här videon. Kompletterande video 3: eNpHR2.0-medierad återställbar bradykardi i D. melanogaster larva. Klicka här för att ladda ner den här videon. Kompletterande video 4: eNpHR2.0-medierad återställbar bradykardi i D. melanogaster puppa. Klicka här för att ladda ner den här videon. Kompletterande video 5: Hjärtpacing genom aktiverad ReaChR i D. melanogaster larv. Klicka här för att ladda ner den här videon. Kompletterande video 6: Hjärtpacing genom aktiverad ReaChR i D. melanogaster puppa. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Discussion

Jämfört med våra tidigare rapporter där uttrycket av opsiner drevs inte bara i hjärtat utan också i de omgivande muskelvävnaderna, rapporterar det nuvarande arbetet med hjälp av en hjärtspecifik drivrutin, Hand-GAL4. Denna nya Hand> opsin genetiska konfiguration som används för optogenetisk hjärtreglering bekräftar ytterligare tidigare rapporterade resultat och etablerar en bättre Drosophila kardiovaskulär forskningsmodell.

Medieförberedelser är avgörande för att experimenten ska lyckas. Opsinproteiner kräver en ligand, all-trans retinal (ATR), för att fungera28. Flugor producerar inte tillräckligt med ATR, så ATR måste kompletteras med flugmedia. I denna studie ersattes den tidigare rapporterade snabbmaten med Semi-Defined media29. Det nya receptet på ATR-innehållande media introducerades för att säkerställa en enhetlig fördelning av ATR. ATR är inte lösligt i vatten; När etanolbaserad 100 mM ATR-stam tillsätts till vattenbaserade medier sprids den genom virvelbildning av injektionsflaskorna som innehåller varma halvdefinierade medier. Dessutom sänktes den tidigare rapporterade ATR-koncentrationen från 10 mM för eNpHR2,0 och 3 mM för ReaChR22 till en slutlig koncentration på 1 mM för båda. Denna koncentration är tillräcklig för att säkerställa korrekt eNpHR2.0 och ReaChR-funktion.

En viktig del av den experimentella framgången är den förbättrade databehandlingen med FlyNet 2.027. Laboratoriet har fortsatt att utveckla denna programvara för att förbättra både beräkningseffektiviteten och noggrannheten hos den automatiserade flughjärtsegmenteringsalgoritmen. Tvärsnittsmaskerna som produceras av denna programvara används för att härleda Drosophila fysiologiska data såsom fraktionerad förkortning och hjärtväggshastighet. Detta tillvägagångssätt har möjliggjort effektiv dataanalys med minimal mänsklig övervakning, vilket gör det snabbare och mer tillförlitligt att karakterisera hjärtfunktionen för stora flyghjärtavbildningsdataset.

Hjärtinfarkt är fortfarande den främsta dödsorsaken, och myokardiell ischemi bidrar till två tredjedelar av alla fall av hjärtsvikt, som snabbt växer fram bland de främsta orsakerna till dödlighet och sjuklighet i USA30. Utvecklingen av nya terapier och medicintekniska produkter kräver djup kunskap om mekanismerna för hjärtsjukdomar på fysiologiska och biokemiska nivåer. Dessa mål kan uppnås med hjälp av modellorganismer. D. melanogaster har etablerat sig som en av de mest pålitliga och effektiva modellerna 31,32,33,34,35. Detta arbete har genererat de simulerade Drosophila-hjärtsjukdomarsmodellerna inducerade av ett icke-invasivt optogenetiskt tillvägagångssätt. Utvecklingen av icke-invasiv optisk hjärtpacingteknik ger en grund för att utveckla ett alternativ till traditionella elektriska hjärtpacing-enheter. Genom att använda OCT för att observera hjärtfunktionen i realtid kan studier exakt karakterisera relevant hjärtfysiologi i Drosophila-modeller för avancerade undersökningar, inklusive screening av läkemedelskandidater. OCT-avbildning har ett penetrationsdjup på ~ 1 mm, vilket fungerar bra för Drosophila-hjärtstudier men begränsar dess användning för att karakterisera hjärtfunktionen i större djurmodeller. Dessutom är det en utmaning att direkt översätta Drosophila-forskning till däggdjursmodeller. Nya optogenetiska verktyg måste utvecklas för att förbättra opsinernas känslighet och översätta dem till olika modellsystem, inklusive zebrafiskar, möss, råttor och mänskliga hjärtorganoider, för kardiovaskulär forskning.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna tackar Andrey Komarov, Yuxuan Wang och Jiantao Zhu för deras hjälp med dataanalys och tackar Zhou-labbmedlemmarna för deras värdefulla diskussioner. Arbetet i Dr. Zhous laboratorium stöddes av en startfond från Washington University i St. Louis, National Institutes of Health (NIH) beviljar R01-EB025209 och R01-HL156265 och Clayco Foundation Innovative Research Award.

Materials

All-trans retinal Cayman Chemicals 18449
Bacto Peptone Gibco 02-10-2025
BioLED Light Source Control Module, 4-channel Migtex Systems BLS-SA04-US Part of the optogenetic stimulation module
Broadband Light Source Module Superlum cBLMD-T-850-HP Part of the SD-OCT imaging system
Cobra-S 800 OCT Spectrometers  Wasatch Photonics CS800-840/180-80-OC2K-U3 Part of the SD-OCT imaging system
Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Professtional 34155 tissues
Drosophila agar Genesee Scientific 66-103
Drosophila culture bottles Genesee Scientific 32-131
FlyNet 2.0 Software Z-Lab Custom software for fly heart segmentation and heart function analysis developed in the Zhou lab
High-Power LED Collimator Sources Migtex Systems BLS-LCS-0617-03-22 Part of the optogenetic stimulation module
Inactive dry yeast Genesee Scientific 62-106
Microscope slides AmScope BS-72P
Narrow plugs for Drosophila culture Genesee Scientific 59-200
Narrow vials for Drosophila culture Genesee Scientific 32-116SB
Permanent double-sided tape Scotch
Plugs for Drosophila bottles Genesee Scientific 59-194
Propionic Acid Sigma P1386-1L
SD-OCT control software Z-Lab Custom software for image acquisition and pacing control developed in the Zhou lab
SD-OCT imaging and optogenetic pacing system Z-Lab Imaging and optogenetic pacing system developed in the Zhou lab (~$50k BOM)
Sucrose Carolina 89-2871
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2 Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) stock # 41752 eNpHR2.0 transgenic line
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) stock # 53748 ReaChR transgenic line
w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) stock # 48396 Heart specific GAL4 driver containing Hand gene regulatory fragment
y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) stock #6658 GFP reporter line
Yeast extract Lab Scientific bioKEMIX 978-907-4243
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nature Methods. Method of the Year 2010. Nature Methods. 8, 1 (2011).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  3. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  4. Tsai, H. -. C. Phasic firing in dopaminergic neurons is sufficient for behavioral conditioning. Science. 324 (5930), 1080-1084 (2009).
  5. Wykes, R. C., et al. Optogenetic and potassium channel gene therapy in a rodent model of focal neocortical epilepsy. Science Translational Medicine. 4 (161), (2012).
  6. Entcheva, E., Kay, M. W. Cardiac optogenetics: a decade of enlightenment. Nature Reviews Cardiology. 18 (5), 349-367 (2021).
  7. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
  8. Arrenberg, A. B., Stainier, D. Y. R., Baier, H., Huisken, J. Optogenetic control of cardiac function. Science. 330 (6006), 971-974 (2010).
  9. Nussinovitch, U., Gepstein, L. Optogenetics for in vivo cardiac pacing and resynchronization therapies. Nature Biotechnology. 33 (7), 750-754 (2015).
  10. Nyns, E. C. A., et al. An automated hybrid bioelectronic system for autogenous restoration of sinus rhythm in atrial fibrillation. Science Translational Medicine. 11 (481), (2019).
  11. Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342 (1), 1-11 (2004).
  12. Wolf, M. J., Amrein, H., Izatt, J. A., Choma, M. A., Reedy, M. C., Rockman, H. A. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (5), 1394-1399 (2006).
  13. Yu, L., Lee, T., Lin, N., Wolf, M. J. Affecting rhomboid-3 function causes a dilated heart in adult Drosophila. PLOS Genetics. 6 (5), 1000969 (2010).
  14. Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. Journal of Visualized Experiments. (33), e1596 (2009).
  15. Zhu, Y. C., Yocom, E., Sifers, J., Uradu, H., Cooper, R. L. Modulatory effects on Drosophila larva hearts: Room temperature, acute and chronic cold stress. Journal of Comparative Physiology. B, Biochemical, Systemic, and Environmental Physiology. 186 (7), 829-841 (2016).
  16. Zhu, Y. C., Uradu, H., Majeed, Z. R., Cooper, R. L. Optogenetic stimulation of Drosophila heart rate at different temperatures and Ca2+ concentrations. Physiological Reports. 4 (3), 12695 (2016).
  17. Malloy, C., et al. Using optogenetics to assess neuroendocrine modulation of heart rate in Drosophila melanogaster larvae. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 203 (10), 791-806 (2017).
  18. Men, J., et al. Drosophila preparation and longitudinal imaging of heart function in vivo using optical coherence microscopy (OCM). Journal of Visualized Experiments. (118), e55002 (2016).
  19. Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114 (2), 35-36 (2006).
  20. Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer’s disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Current Alzheimer Research. 8 (3), 313-322 (2011).
  21. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Human Molecular Genetics. 22 (18), 3798-3806 (2013).
  22. Men, J., Li, A., Jerwick, J., Li, Z., Tanzi, R. E., Zhou, C. Non-invasive red-light optogenetic control of Drosophila cardiac function. Communications Biology. 3 (1), 1-10 (2020).
  23. Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster. Science Advances. 1 (9), 1500639 (2015).
  24. Stanley, C. E., Mauss, A. S., Borst, A., Cooper, R. L. The effects of chloride flux on Drosophila heart rate. Methods and Protocols. 2 (3), 73 (2019).
  25. Lindsley, D. L., Zimm, G. G. . The Genome of Drosophila melanogaster. , (1992).
  26. . Bloomington Drosophila Stock Center Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/germanfood.html (2022)
  27. Dong, Z., et al. FlyNet 2.0: Drosophila heart 3D (2D + time) segmentation in optical coherence microscopy images using a convolutional long short-term memory neural network. Biomedical Optics Express. 11 (3), 1568-1579 (2020).
  28. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  29. Backhaus, B., Sulkowski, E., Schlote, F. W. A semi-synthetic, general-purpose medium for Drosophila melanogaster. Drosophila Information Service. 60, 210-212 (1984).
  30. Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2019 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 139 (10), 56 (2019).
  31. Wolf, M. J., Rockman, H. A. Drosophila, genetic screens, and cardiac function. Circulation Research. 109 (7), 794-806 (2011).
  32. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Disease Models & Mechanisms. 4 (3), 411-420 (2011).
  33. Ocorr, K., Vogler, G., Bodmer, R. Methods to assess Drosophila heart development, function and aging. Methods [Supplement to Methods in Enzymology]. 68 (1), 265-272 (2014).
  34. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
  35. Rotstein, B., Paululat, A. On the morphology of the Drosophila heart. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3 (2), 15 (2016).

Tags

Drosophila MelanogasterOptogenetic ControlCardiac FunctionOCT ImagingOptogenetic PacingHeart Disease ModelsNon-invasive ImagingHeart OrganoidsZebrafishEmbryonic Heart
check_url/cn/63939?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gracheva, E., Wang, F., Matt, A., Liang, H., Fishman, M., Zhou, C. Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function. J. Vis. Exp. (186), e63939, doi:10.3791/63939 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image