심장 기능의 영상 및 광유전학적 제어를 위한 초파리 멜라노가스터 모델 개발
Summary
본 프로토콜은 OCT 영상화 및 광유전학적 심장 페이싱을 위해 심장에서 eNpHR2.0 또는 ReaChR 옵신을 발현하는 초파리 멜라노가스터의 생성을 기술한다. 초파리 OCT 영상 및 심장 박동 조절에 대한 자세한 지침, 다른 발달 단계에서 살아있는 동물에서 회복 가능한 심장 마비, 서맥 및 빈맥의 시뮬레이션을 포함하여보고됩니다.
Abstract
초파리 멜라노가스트r(초파리)을 모델 유기체로 사용하여 세포 조직 및 게놈 조사에서 행동 연구에 이르기까지 생물 과학의 많은 분야에서 상당한 진전을 보장했습니다. 축적 된 과학 지식으로 인해 최근 몇 년 동안 초파리는 심장 질환을 포함한 인간 질병을 모델링하는 분야로 옮겨졌습니다. 제시된 연구는 침습적 인 절차없이 적색 광 (617 nm)을 사용하여 전체 살아있는 유기체의 맥락에서 심장 기능을 모니터링하고 조작하기위한 실험 시스템을 설명합니다. 심장에 대한 제어는 광유전학적 도구를 사용하여 달성되었다. 광유전학은 광-민감성 트랜스제닉 옵신의 발현과 이들의 광학적 활성화를 결합하여 관심있는 생물학적 조직을 조절한다. 이 연구에서는 맞춤형 통합 광학 간섭 단층 촬영 (OCT) 이미징 및 광유전 자극 시스템을 사용하여 3 번째 인스타 애벌레 및 초기 번데기 발달 단계에서 기능하는 D. melanogaster 심장을 시각화하고 변조했습니다. UAS/GAL4 이중 유전 시스템은 특히 파리 심장에서 할로로돕신(eNpHR2.0)과 적색 편이 채널로돕신(ReaChR)을 발현하기 위해 사용되었다. 살아있는 OCT 이미징 및 광유전학적 페이싱을 위한 D. melanogaster를 준비하는 것에 대한 세부사항이 제공된다. 실험실에서 개발한 통합 소프트웨어는 이미징 데이터를 처리하여 초파리 심장 기능의 시각적 프리젠테이션과 정량적 특성을 생성했습니다. 결과는 eNpHR2.0 활성화로 인한 심장 마비 및 서맥을 시작하고 ReaChR 활성화시 심장 박동을 수행 할 수있는 타당성을 보여줍니다.
Introduction
2010 년 말에 Nature Methods 저널은 광유전학을Year 1의 방법으로 선택했습니다. 빛에 의해 조절되는 유전자 도구(트랜스제닉 옵신)를 사용하여 관심 있는 생물학적 조직을 전례 없는 정밀도와 속도로 제어함으로써 새로운 응용을 위한 홍수 게이트가 열렸습니다. 현재까지 대부분의 업적은 신경 과학에 속합니다. 이 기술은 단일 뉴런2의 정밀한 조절을 위한 새로운 방법으로 도입되었으며, 살아있는 유기체 인지 기능3의 영역에서 발견으로 발전했다. 처음부터 신경 과학자들은 전체 유기체의 행동을 조절하는 능력을 보여주었습니다. 마우스 도파민성 뉴런에서 ChR2 옵신의 발현 및 광 활성화는 그들의 활성화를 야기하고 행동 컨디셔닝을 유도하기에 충분하였다4. 설치류 뇌의 간질 초점으로 전달된 할로로돕신 NpHR2.0을 함유하는 뉴런의 서브세트의 광유전학적 억제는 뇌전도 발작의 감쇠를 초래하였다5.
심장학에서의 광유전학적 응용은 꾸준한 속도로 발전하고 있다6. ChR2는 심근세포 세포 배양물 및 마우스에서 성공적으로 발현되었고; 심장 간격은 청색광의 섬광에 의해 수행되었다(살아있는 동물에 이식된 섬유를 사용하여 수행됨)7. 제브라피쉬에서, ChR2는 페이스-메이킹 심장 영역을 식별하기 위해 표현되고 사용되었다; NpHR 활성화는 심장 마비를 유도했다8. 광유전학적 심장 페이싱은 새로운 페이싱 및 재동기화 요법을 개발할 수 있는 독특한 잠재력을 가지고 있다9. 자생 부정맥 종결 시스템을 구축하려는 시도는 최근10 개뿐만 아니라보고되었습니다.
광범위한 연구와 새로운 치료 치료법의 개발은 세포 배양에서 포유류에 이르기까지 다양한 모델 시스템의 적용을 필요로합니다. 척추 동물의 심장은 매우 복잡한 기관입니다. 심근 세포 (CM)는 모든 심장 세포의 삼분의 일을 포함한다; 다른 세포는 뉴런, 혈관 평활근 세포, 및 비-흥분성 세포 (즉, 내피 세포, 섬유아세포, 및 면역 세포)를 포함한다. CM 세포 배양을 연구하는 것은 얻어진 결과의 번역을 인간 의료 응용에 제한한다. 포유류 모델 유기체의 유전자 조작은 제한적이고 시간이 많이 걸립니다. 더 작은 무척추 동물 모델에는 많은 장점이 있습니다. 그들의 심장 혈관 시스템은 모든 필수 조직 학적 요소를 운반합니다. 초파리 멜라노가스터(fruit fly)는 심장 질환11,12,13을 포함한 인간 질병과 관련된 유전자의 역할을 조사하는 간단하고 강력한 유전자 모델 시스템이다. 수명이 짧은 동물로서, 초파리는 일생 동안 추적 할 수있는 연령 또는 질병 의존적 인 심장 기능 변화를 모델링 할 수있는 훌륭한 기회를 나타냅니다14,15,16,17. 초파리의 심장 튜브는 큐티클 표면에서 200 μm 이내에 신체의 등쪽 측면에 위치하여 가시 광선에서 근적외선이 심장 튜브에 도달 할 수 있도록합니다. 이 해부학 적 특징은 기존의 광유전학 도구를 사용하여 초파리 심장의 비 침습적 광 페이싱을 가능하게합니다.
초파리 심장을 모니터링하기 위해, 적색광 LED 여기 모듈이 통합된 맞춤형 스펙트럼 도메인 광학 간섭 단층촬영(SD-OCT) 이미징 시스템이 개발되었다(18). 비교적 단순한 초파리 심장의 형태학적 및 리듬적 변화는 이러한 비침습적 생물의학 영상 기술(12,19,20,21)로 쉽게 분석될 수 있다. 향상된 광학 단면화 성능과 미크론 스케일 공간 분해능을 갖춘 OCT는 구조를 조사하고 3 번째 인스타 유충과 초기 번데기18을 포함한 다양한 발달 단계에서 초파리 심장의 기능을 모니터링하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 이 시스템은 또한 손상되지 않은 동물의 초파리 심장 상태를 동시에 모니터링하고 자극 할 수 있습니다. OCT 시스템의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다. SD-OCT 시스템은 광원으로 초발광 다이오드(SLD)를 사용합니다(중심 파장: 850nm± 10nm, FWHM: 165nm, 재료 표 참조). 10x 대물 렌즈를 사용하여, OCT 이미징 시스템은 공기 중에서 ~4.4 μm, 조직에서 ~3.3 μm의 축방향 분해능 및 ~2.8 μm의 측방 분해능을 달성할 수 있으며, 이는 파리 심장 구조(18,22)의 미세한 디테일을 해결하기에 충분하다. 기준 암과 샘플 암으로부터의 반사광의 간섭 신호는 2048픽셀 라인 스캔 카메라가 장착된 분광계를 사용하여 검출된다(최대 라인 레이트: 80kHz, 재료 표 참조). 측정된 시스템 감도는 ~95.1dB입니다. 각 B 모드 OCT 스캔은 xz 이미지 평면에서 횡단면 이미지를 생성합니다. 반복되는 B 모드 이미지는 동일한 위치에서 획득되어 ~ 30 초이상 18,22,23 동안 박동하는 심장을 캡처하는 M 모드 이미지를 생성합니다. M 모드 이미징의 프레임 속도는 ~ 125 프레임 / 초이며 초파리의 심장 박동 역학을 포착하기에 충분합니다.
초파리 심장 기능의 광유전학적 조절을 위해, 617nm LED 광원을 가진 조명 모듈이 SD-OCT 시스템의 샘플 암과 통합된다. 자극광은 이미징 초점 스폿과 동일한 위치에서 시편 표면의 ~2.2mm 직경 스폿에 초점을 맞춥니다. 사용자 정의 서면 소프트웨어는 조명 모드(광도, 펄스 폭 및 듀티 사이클)를 제어하고, 광 펄스 자극 주파수를 조정하고, LED 모듈 조명과 M 모드 OCT 이미징 획득(22)을 동기화하는데 이용된다.
최근 간행물은 UAS/GAL4 유전자 시스템을 사용하여 시공간적으로 조절된 ChR2, ReaChR 및 eNpHR2.0 옵신으로 구성된 초파리 트랜스제닉 시스템을 기술하였다. 얻어진 결과는 eNpHR2.0의 적색광 활성화와 ChR2의 청색광 활성화로 인한 더 높은 주파수 심장 간격으로 인한 심정지 및 서맥을 개시하는 능력을 입증하였다. 유사한 페이싱 실험은 적색광 조명22,23,24에 의해 유도되는 또 다른 채널로돕신, ReaChR과 함께 수행되었다. 기술된 모든 실험에서 옵신 발현은 24B-GAL4에 의해 구동되었고, 여기서 옵신 발현은 심근세포 및 주변 근육 세포를 포함하는 광범위한 조직에서 관찰되었다. 현재 연구에서, 24B-GAL4는 심장 특이적 eNpHR2.0 및 ReaChR 옵신 발현을 달성하기 위해 Hand-GAL4 드라이버로 대체되었다.
전반적으로, 제시된 실험 결과는 회복 가능한 심장 마비 및 유도성 서맥 및 빈맥 심장 상태를 보여줍니다. 트랜스제닉 초파리 모델을 만들고 살아있는 동물에서 동시에 OCT 이미징 및 광유전학적 페이싱 실험을 수행하는 방법에 대한 단계별 지침이 포함된 상세한 프로토콜이 제공됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
옵신의 발현이 심장뿐만 아니라 주변 근육 조직에서도 주도 된 이전 보고서와 비교할 때, 본 연구는 심장 특정 운전자 인 Hand-GAL4를 사용하여보고합니다. 광유전학적 심장 조절에 사용되는 이 새로운 손> 옵신 유전자 구성은 이전에 보고된 결과를 더욱 확인하고 더 나은 초파리 심혈관 연구 모델을 확립한다.
미디어 준비는 실험의 성공을 위해 필수적입니다. 옵신 단백질은28을 기능하기 위해 리간드, 모든 트랜스 망막 (ATR)을 필요로 한다. 파리는 충분한 ATR을 생산하지 못하기 때문에 ATR을 비행 매체에 보충해야합니다. 이 연구에서, 이전에 보고된 인스턴트 식품은 세미-정의 미디어(Semi-Defined media)(29)로 대체되었다. ATR의 균일한 분포를 보장하기 위해 ATR 함유 배지의 새로운 레시피가 도입되었습니다. ATR은 물에 용해되지 않습니다; 에탄올계 100 mM ATR 스톡이 수성 배지에 첨가될 때, 따뜻한 세미-정의 배지를 함유하는 바이알을 볼텍싱함으로써 분산된다. 또한, 이전에 보고된 ATR 농도는 eNpHR2.0의 경우 10 mM, ReaChR22의 경우 3 mM에서 둘 다에 대해 1 mM 최종 농도로 감소되었다. 이 농도는 적절한 eNpHR2.0 및 ReaChR 기능을 보장하기에 충분합니다.
실험 성공의 중요한 구성 요소는 FlyNet 2.027을 사용한 향상된 데이터 처리입니다. 실험실은 자동화 된 비행 심장 세분화 알고리즘의 계산 효율성과 정확성을 향상시키기 위해이 소프트웨어를 계속 개발해 왔습니다. 이 소프트웨어에 의해 생성 된 횡단면 마스크는 분수 단축 및 심벽 속도와 같은 초파리 생리 학적 데이터를 도출하는 데 사용됩니다. 이 접근 방식은 최소한의 인간 감독으로 효율적인 데이터 분석을 가능하게하여 대형 비행 심장 영상 데이터 세트에 대한 심장 기능을 특성화하는 것이 더 빠르고 신뢰할 수 있도록합니다.
심근 경색은 여전히 사망의 주요 원인으로 남아 있으며, 심근 허혈은 심부전의 모든 사례의 3 분의 2에 기여하며, 이는 미국에서 사망률과 이환의 주요 원인 중 빠르게 부상하고 있습니다30. 새로운 치료제 및 의료 기기의 개발은 생리 학적 및 생화학 적 수준에서 심장 장애의 메커니즘에 대한 깊은 지식을 필요로합니다. 이러한 목표는 모델 유기체의 도움으로 달성 될 수 있습니다. D. melanogaster는 가장 신뢰할 수 있고 효율적인 모델31,32,33,34,35 중 하나로 자리 매김했습니다. 이 연구는 비침습적 광유전학적 접근법에 의해 유도된 시뮬레이션된 초파리 심장 장애 모델을 생성하였다. 비침습적 광 심장 페이싱 기술의 개발은 전통적인 전기 심장 페이싱 장치에 대한 대안을 개발하기위한 기반을 제공합니다. OCT를 사용하여 심장 기능을 실시간으로 관찰하면 약물 후보 선별을 포함한 고급 조사를 위해 초파리 모델에서 관련 심장 생리학을 정확하게 특성화하는 연구가 가능합니다. OCT 이미징은 ~ 1mm의 침투 깊이를 가지며, 이는 초파리 심장 연구에 적합하지만 더 큰 동물 모델에서 심장 기능을 특성화하는 데 사용이 제한됩니다. 또한, 초파리 연구를 포유류 모델로 직접 번역하는 것은 어려운 과제입니다. 옵신의 민감도를 개선하고 심혈관 연구를 위해 제브라피쉬, 생쥐, 쥐 및 인간 심장 오가노이드를 포함한 다양한 모델 시스템으로 변환하기 위해 새로운 광유전학 도구를 개발해야 합니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 Andrey Komarov, Yuxuan Wang 및 Jiantao Zhu에게 데이터 분석에 도움을 준 것에 대해 감사하고 Zhou 실험실 회원들에게 귀중한 토론에 감사드립니다. 저우 박사의 실험실에서의 작업은 세인트루이스의 워싱턴 대학의 창업 기금, 국립 보건원 (NIH) 보조금 R01-EB025209 및 R01-HL156265 및 클레이코 재단 혁신 연구 상.
Materials
| All-trans retinal | Cayman Chemicals | 18449 | |
| Bacto Peptone | Gibco | 02-10-2025 | |
| BioLED Light Source Control Module, 4-channel | Migtex Systems | BLS-SA04-US | Part of the optogenetic stimulation module |
| Broadband Light Source Module | Superlum | cBLMD-T-850-HP | Part of the SD-OCT imaging system |
| Cobra-S 800 OCT Spectrometers | Wasatch Photonics | CS800-840/180-80-OC2K-U3 | Part of the SD-OCT imaging system |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professtional | 34155 | tissues |
| Drosophila agar | Genesee Scientific | 66-103 | |
| Drosophila culture bottles | Genesee Scientific | 32-131 | |
| FlyNet 2.0 Software | Z-Lab | Custom software for fly heart segmentation and heart function analysis developed in the Zhou lab | |
| High-Power LED Collimator Sources | Migtex Systems | BLS-LCS-0617-03-22 | Part of the optogenetic stimulation module |
| Inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-106 | |
| Microscope slides | AmScope | BS-72P | |
| Narrow plugs for Drosophila culture | Genesee Scientific | 59-200 | |
| Narrow vials for Drosophila culture | Genesee Scientific | 32-116SB | |
| Permanent double-sided tape | Scotch | ||
| Plugs for Drosophila bottles | Genesee Scientific | 59-194 | |
| Propionic Acid | Sigma | P1386-1L | |
| SD-OCT control software | Z-Lab | Custom software for image acquisition and pacing control developed in the Zhou lab | |
| SD-OCT imaging and optogenetic pacing system | Z-Lab | Imaging and optogenetic pacing system developed in the Zhou lab (~$50k BOM) | |
| Sucrose | Carolina | 89-2871 | |
| w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 41752 | eNpHR2.0 transgenic line |
| w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 53748 | ReaChR transgenic line |
| w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 48396 | Heart specific GAL4 driver containing Hand gene regulatory fragment |
| y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock #6658 | GFP reporter line |
| Yeast extract | Lab Scientific bioKEMIX | 978-907-4243 |
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