액체와 얼음에서 바이러스 어셈블리의 고해상도 이미징 향상
Summary
여기에서는 투과 전자 현미경을 사용하여 나노 스케일에서 액체-EM 및 Cryo-EM 분석에 적합한 바이러스 어셈블리를 준비하는 프로토콜에 대해 설명합니다.
Abstract
과학자들이 이제 나노 스케일에서 실시간 프로세스를 관찰할 수 있게 되면서 액체 전자 현미경(액체-EM)에 대한 관심이 최근 몇 년 동안 급증했습니다. 많은 이벤트가 밀리초 범위 또는 더 빠른 시간 척도에서 발생하므로 고분해능 Cryo-EM 정보를 동적 관찰과 페어링하는 것이 매우 바람직합니다. 유연한 구조에 대한 향상된 지식은 SARS-CoV-2와 같은 신종 병원체와 싸우기 위한 새로운 시약의 설계에도 도움이 될 수 있습니다. 더 중요한 것은 유체 환경에서 생물학적 물질을 보는 것이 인체에서의 성능을 독특하게 엿볼 수 있다는 것입니다. 여기에 액체 및 유리질 얼음에서 바이러스 어셈블리의 나노 스케일 특성을 조사하기 위해 새로 개발 된 방법이 제시됩니다. 이 목표를 달성하기 위해 잘 정의된 샘플이 모델 시스템으로 사용되었습니다. 샘플 준비 방법과 대표적인 구조 정보의 나란히 비교가 제시됩니다. 서브 나노 미터 특징은 ~ 3.5-Å-10 Å 범위에서 분해 된 구조에 대해 표시됩니다. 이 보완적인 프레임워크를 뒷받침하는 다른 최근 결과에는 백신 후보에 대한 동적 통찰력과 액체로 이미지화된 항체 기반 치료법이 포함됩니다. 전반적으로 이러한 상관 응용 프로그램은 분자 역학을 시각화하는 능력을 향상시켜 인간의 건강과 질병에서 사용할 수 있는 고유한 컨텍스트를 제공합니다.
Introduction
생물 의학 연구는 새로운 기술 개발을 통해 인간의 건강과 질병에 대한 이해를 향상시킵니다. 고해상도 이미징은 나노 세계에 대한 우리의 관점을 변화시키고 있으며, 세포와 분자를정교하게 1,2,3,4,5 연구할 수 있게 해줍니다. 연질 폴리머, 단백질 어셈블리 또는 인간 바이러스와 같은 동적 구성 요소의 정적 정보는 복잡한 내러티브의 제한된 스냅 샷 만 보여줍니다. 분자 개체가 어떻게 작동하는지 더 잘 이해하려면 구조와 기능을 공동으로 조사해야 합니다.
원자적으로 얇은 그래핀 또는 실리콘 기반 마이크로칩과 같은 재료 생산의 최근 발전은 투과 전자 현미경(TEM)을 사용한 실시간 구조 기능 분석을 위한 새로운 기회를 제공합니다. 이러한 재료는 라이브 EM 이미징 6,7,8,9,10,11을 위해 밀폐된 챔버를 생성할 수 있습니다. Cryo-EM과 상관 관계가 있는 실온인 액체-EM의 새로운 분야는 용액의 단단하거나 부드러운 물질에 대한 전례 없는 보기를 제공하여 과학자들이 시편의 구조와 역학을 동시에 연구할 수 있도록 합니다. Liquid-EM 애플리케이션에는 암 줄기 세포와 상호 작용하는 치료용 나노입자의 실시간 기록과 바이러스 병원체12,13,14의 분자 복잡성 변화가 포함됩니다.
방법론적 발전이 Cryo-EM 분야의 분해능 혁명에 박차를 가한 것처럼, 과학계를 위한 고처리량 도구로서 액체-EM의 사용을 확장하기 위해서는 새로운 기술과 방법이 필요합니다. 여기에 제시된 방법의 전반적인 목표는 액체-EM 시편 준비 프로토콜을 간소화하는 것입니다. 개발된 기술의 이면에 있는 이론적 근거는 액체 및 극저온 EM 데이터 수집 모두에 적합한 새로운 마이크로칩 설계 및 오토로더 장치를 사용하는 것입니다(그림 1)7,14,15,16,17. 어셈블리는 세션당 여러 샘플을 수용할 수 있는 Krios 또는 F200C TEM과 같은 자동화 기기용 표준 그리드 클립을 사용하여 기계적으로 밀봉됩니다(그림 2). 이 방법론은 표준 Cryo-EM 애플리케이션을 넘어 고해상도 이미징의 사용을 확장하여 실시간 재료 분석의 더 넓은 목적을 보여줍니다.
현재 비디오 기사에서는 상업적으로 이용 가능한 표본 홀더가 있거나없는 액체로 바이러스 어셈블리를 준비하기위한 프로토콜이 제시됩니다. 액체-EM용 특수 시편 홀더를 사용하면 얇은 액체 시편은 Cryo-EM 샘플에 필적하는 구조 정보와 시편의 동적 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 고처리량 루틴을 위해 자동 로더 도구를 사용하여 액체 표본을 준비하는 방법도 시연됩니다. 다른 기술에 비해 가장 큰 장점은 자동화된 시편 생산을 통해 사용자가 데이터 수집 전에 최적의 두께와 전자 선량에 대해 샘플을 신속하게 평가할 수 있다는 것입니다. 이 스크리닝 기술은 액체 또는 얼음12,14,18,19에서 실시간 기록에 이상적인 영역을 신속하게 식별합니다. 3D 구조 측정을 위해 액체-EM은 Cryo-EM에 구현된 오랫동안 확립된 Cryo-EM 분석법을 보완할 수 있습니다. 기존 TEM 또는 Cryo-EM 기술을 사용하는 독자는 현재 전략을 보완하는 방식으로 샘플에 대한 새롭고 역동적인 관찰을 제공하기 위해 액체-EM 워크플로우를 사용하는 것을 고려할 수 있습니다.
이 프로토콜에 사용되는 바이러스 샘플은 기증으로 수득되고 표준 조건12 하에서 배양된 정제된 아데노-관련 바이러스 서브타입 3 (AAV)을 포함한다. 또한 COVID-19 환자12의 혈청에서 파생되고 상업적 출처에서 얻은 비감염성 SARS CoV-2 하위 바이러스 어셈블리도 사용되었습니다. 마지막으로, 정제된 유인원 로타바이러스(SA11 균주) 이중층 입자(DLP)를 웨이크 포레스트 대학의 Sarah M. McDonald Esstman 박사의 실험실에서 얻고 표준 조건 6,17을 사용하여 배양했습니다. 여기에 설명된 소프트웨어 패키지는 무료로 사용할 수 있으며 링크는 재료 표 섹션에 제공되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cryo-EM 분야에서 채택된 새로운 자동화 도구 및 기술을 사용하여 현재 액체-EM 워크플로우를 간소화할 수 있는 새로운 기회가 제시됩니다. 새로운 마이크로칩 샌드위치 기술과 관련된 응용 분야는 액체 또는 유리질 얼음에서 고해상도 이미징 분석을 가능하게 하기 때문에 다른 방법과 관련하여 중요합니다. 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나는 나노 스케일 수준에서 정교한 세부 사항을 시각?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 정제 된 AAV-3를 제공 한 Luk H. Vandenberghe 박사 (하버드 의과 대학 안과학과)를 인정합니다. 이 연구는 국립 보건원과 국립 암 연구소 (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700에서 DFK까지)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 Liter |
| Autoloader clipping tool | ThermoFisher Scientific | N/A | Also SubAngstrom supplier |
| Autoloader grid clips | ThermoFisher Scientific | N/A | top and bottom clips |
| Carbon-coated gold EM grids | Electron Microcopy Sciences | CF400-AU-50 | 400-mesh, 5-nm thickness |
| COVID-19 patient serum | RayBiotech | CoV-Pos-S-500 | 500 microliters of PCR+ serum |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 Liter |
| Microwell-integrad microchips | Protochips, Inc. | EPB-42A1-10 | 10×10-mm window arrays |
| TEMWindows microchips | Simpore Inc. | SN100-A10Q33B | 9 large windows, 10-nn thick |
| TEMWindows microchips | Simpore, Inc. | SN100-A05Q33A | 9 small windows, 5-nm thick |
| Top microchips | Protochips, Inc. | EPT-50W | 500 mm x 100 mm window |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Equipment | |||
| DirectView direct electron detector | Direct Electron | 6-micron pixel spacing | |
| Falcon 3 EC direct electron detector | ThermoFisher Scientific | 14-micron pixel spacing | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| Mark IV Vitrobot | ThermoFisher Scientific | state-of-the-art specimen preparation unit | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Poseidon Select specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible;specimen holder | |
| Talos F200C TEM | ThermoFisher Scientific | 200 kV; Liquid-TEM | |
| Titan Krios G3 | ThermoFisher Scientific | 300 kV; Cryo-TEM | |
| Freely available software | Website link | Comments (optional) | |
| cryoSPARC | https://cryosparc.com/ | other image processing software | |
| CTFFIND4 | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | CTF finding program | |
| MotionCorr2 | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | ||
| RELION | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page | ||
| SerialEM | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | ||
| UCSF Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | molecular structure analysis software package |
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