厚い自由浮遊組織切片におけるアストロサイトの領域体積とタイリングの解析

アストロサイトは、脳内で多くの重要な機能を果たす精巧に分岐した細胞^です1。マウス皮質では、放射状グリア幹細胞は、後期胚期および出生後早期の段階²の間にアストロサイトを生じる。出生後最初の3週間の間に、アストロサイトはサイズと複雑さを増し、シナプスと直接相互作用する何千もの細かい枝を発達させます¹。同時に、アストロサイトは隣接するアストロサイトと相互作用して、ギャップジャンクションチャネル⁴を介した通信を維持しながら、脳³をタイル状にするための離散的で重複しない領域を確立する。アストロサイトの形態および組織は、侮辱または傷害に続く多くの疾患状態において破壊され⁵、適切な脳機能のためのこれらのプロセスの重要性を示す。正常な発達、老化、および疾患中のアストロサイトの形態学的特性の分析は、アストロサイトの生物学および生理学に関する貴重な洞察を提供することができる。さらに、遺伝子操作後のアストロサイト形態の解析は、アストロサイトの形態学的複雑さの確立と維持を支配する細胞および分子メカニズムを識別するための貴重なツールです。

マウス脳におけるアストロサイト形態の解析は、アストロサイト分岐の複雑さとアストロサイトタイリングの両方によって複雑になる。中間フィラメントグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)をアストロサイト特異的マーカーとして用いた抗体染色は、主要な枝のみを捕捉し、アストロサイトの形態学的複雑さを非常に過小評価している¹。グルタミン酸トランスポーター1(GLT-1;slc1a2)、グルタミン合成酵素、またはS100βなどの他の細胞特異的マーカーは、アストロサイト枝⁶を標識するより良い仕事をするが、新しい問題を導入する。アストロサイトの領域は大部分が重なり合っていないが、周辺縁にはわずかな程度の重なりが存在する。分岐の複雑さのために、隣接するアストロサイトが同じ色でラベル付けされている場合、一方のアストロサイトがどこで終わり、もう一方が始まるかを区別することは不可能である。内因性蛍光タンパク質によるアストロサイトのスパースまたはモザイク標識は、両方の問題を解決します:蛍光マーカーは、すべての枝を捕捉するために細胞を満たし、それらの隣人と区別することができる個々のアストロサイトのイメージングを可能にします。ウイルス注射、プラスミドエレクトロポレーション、またはトランスジェニックマウス系統を含む、遺伝子操作の有無にかかわらず、アストロサイトのまばらな蛍光標識を達成するために、いくつかの異なる戦略が使用されてきた。これらの戦略の実行に関する詳細は、以前に発表された研究およびプロトコル1、⁷、^8、9、¹⁰、¹¹、^12、13に記載されている。

この記事では、まばらなアストロサイトの集団において、蛍光標識を用いてマウス脳からのアストロサイト領域体積を測定する方法について説明します(図1)。マウス皮質におけるアストロサイトの平均直径は約60μmであるため、個々のアストロサイト全体を捕捉する効率を向上させるために、厚さ100μmの切片が使用される。免疫染色は必須ではありませんが、共焦点イメージングおよび分析のために内因性蛍光シグナルを増強するために推奨されます。免疫染色はまた、微細なアストロサイト枝のより良い検出を可能にし、画像取得中の内因性タンパク質のフォトブリーチングを低減する可能性がある。厚い切片への抗体の浸透を改善し、切片化からイメージングまでの組織体積を維持するために、自由に浮遊する組織切片が使用される。アストロサイト領域容積の解析は、市販の画像解析ソフトを用いて行う。さらに、このプロトコルは、隣接するアストロサイトが異なる蛍光標識を発現するモザイク標識を有する組織切片におけるアストロサイトタイリングの分析方法を記述する。このプロトコルは、正常な脳発達中のアストロサイト増殖、ならびにアストロサイト発達に対する遺伝子操作の影響を特徴付けるために、いくつかの最近の研究^1,8,9において首尾よく使用されている。