Analisi del volume e della piastrellatura del territorio degli astrociti in sezioni di tessuto fluttuanti spesse

Gli astrociti sono cellule riccamente ramificate che svolgono molte funzioni importanti nel cervello¹. Nella corteccia del topo, le cellule staminali gliali radiali danno origine ad astrociti durante gli stadi embrionale tardivo e postnatale precoce². Durante le prime tre settimane postnatali, gli astrociti crescono in dimensioni e complessità, sviluppando migliaia di rami fini che interagiscono direttamente con le sinapsi¹. Allo stesso tempo, gli astrociti interagiscono con gli astrociti vicini per stabilire territori discreti e non sovrapposti per affiancare il cervello³, pur mantenendo la comunicazione attraverso i canali di giunzione^{del gap 4}. La morfologia e l’organizzazione degli astrociti sono interrotte in molti stati patologici a seguito di insulto o lesione⁵, indicando l’importanza di questi processi per una corretta funzione cerebrale. L’analisi delle proprietà morfologiche degli astrociti durante il normale sviluppo, l’invecchiamento e la malattia può fornire preziose informazioni sulla biologia e la fisiologia degli astrociti. Inoltre, l’analisi della morfologia degli astrociti a seguito di manipolazione genetica è uno strumento prezioso per discernere i meccanismi cellulari e molecolari che governano l’istituzione e il mantenimento della complessità morfologica degli astrociti.

L’analisi della morfologia degli astrociti nel cervello del topo è complicata sia dalla complessità di ramificazione degli astrociti che dalla piastrellatura degli astrociti. La colorazione anticorpale utilizzando la proteina acida fibrillare gliale a filamento intermedio (GFAP) come marcatore specifico per gli astrociti cattura solo i rami principali e sottovaluta enormemente la complessità morfologica degli astrociti¹. Altri marcatori specifici delle cellule come il trasportatore del glutammato 1 (GLT-1; slc1a2), la glutammina sintetasi o S100β fanno un lavoro migliore nell’etichettare i rami degli astrociti⁶, ma introducono un nuovo problema. I territori degli astrociti sono in gran parte non sovrapposti, ma esiste un piccolo grado di sovrapposizione ai bordi periferici. A causa della complessità della ramificazione, quando gli astrociti vicini sono etichettati dello stesso colore, è impossibile distinguere dove finisce un astrocita e inizia l’altro. L’etichettatura sparsa o a mosaico di astrociti con proteine fluorescenti endogene risolve entrambi i problemi: il marcatore fluorescente riempie la cellula per catturare tutti i rami e consente l’imaging di singoli astrociti che possono essere distinti dai loro vicini. Diverse strategie sono state utilizzate per ottenere un’etichettatura fluorescente sparsa degli astrociti, con o senza manipolazione genetica, tra cui iniezione virale, elettroporazione plasmidica o linee di topo transgenico. I dettagli sull’esecuzione di queste strategie sono descritti negli studi e nei protocolli^{precedentemente} pubblicati ^{1,7,8,9,10,11,12,13}.

Questo articolo descrive un metodo per misurare il volume del territorio degli astrociti dal cervello dei topi con etichettatura fluorescente in una popolazione sparsa di astrociti (Figura 1). Poiché il diametro medio di un astrocita nella corteccia del topo è di circa 60 μm, vengono utilizzate sezioni spesse 100 μm per migliorare l’efficienza nella cattura dei singoli astrociti nella loro interezza. L’immunocolorazione non è richiesta, ma è raccomandata per migliorare il segnale fluorescente endogeno per l’imaging e l’analisi confocale. L’immunocolorazione può anche consentire una migliore rilevazione di rami di astrociti fini e ridurre il fotosbiancamento delle proteine endogene durante l’acquisizione dell’immagine. Per migliorare la penetrazione degli anticorpi nelle sezioni spesse e per preservare il volume del tessuto dal sezionamento attraverso l’imaging, vengono utilizzate sezioni di tessuto fluttuanti. L’analisi del volume del territorio astrocitario viene eseguita utilizzando un software di analisi delle immagini disponibile in commercio. Inoltre, questo protocollo descrive un metodo per l’analisi della piastrellatura degli astrociti in sezioni di tessuto con etichettatura a mosaico, in cui gli astrociti vicini esprimono diverse etichette fluorescenti. Questo protocollo è stato utilizzato con successo in diversi studi recenti ^1,8,9 per caratterizzare la crescita degli astrociti durante il normale sviluppo del cervello, così come l’impatto della manipolazione genetica sullo sviluppo degli astrociti.