제1형 당뇨병, 체강 질병 및 COVID-19에 대한 고처리량 멀티플렉스 스크리닝

연구 프로토콜은 콜로라도 다중 기관 검토위원회의 승인을 받았습니다. 1. 완충액 준비 400 mL의 증류수에 10x PBS 100 mL를 첨가하고 NaOH를 사용하여 pH를 7.9로 조정하여 표지 완충액(2x PBS, pH 7.9)을 준비한다. 3mM의 비오틴과 Ru 설포-NHS 만들기: 1μL의 라벨링 버퍼에 588mg의 비오틴을 녹이고 50μL의 라벨링 버퍼에 150nmol의 Ru 설포-NHS를 녹입니다. 항원 완충액(1% BSA)을 준비합니다: 5g의 소 혈청 알부민(BSA)을 500mL의 1x PBS에 녹입니다. 코팅 완충액 (3% 차단제 A)을 준비합니다: 15g의 차단제 A를 500mL의 1x PBS에 녹입니다. 첫 번째 세척 완충액(0.05% 트윈 20, PBST)을 준비한다: 5,000mL의 1x PBS에 2.5mL의 트윈 20을 혼합한다. 두 번째 세척액(0.4 M NaCl)을 준비한다: 575 mL의 증류수에 5 M NaCl 50 mL를 혼합하여 0.4 M NaCl 용액을 만든다.알림: 효율적인 라벨링을 위해 항상 새로 준비된 비오틴 및 Ru Sulfo-NHS 용액을 사용하고 이전에 만든 용액을 보관하지 마십시오. 2. 비오틴과 Ru 설포-NHS를 별도로 사용한 항원 단백질 표지 참고: 더 높은 라벨링 효율을 위해 더 높은 농도의 항원 단백질 ≥0.5mg/mL가 권장됩니다. 프로인슐린, GAD-65, IA-2, ZnT8, TG 및 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD)을 포함한 6가지 표적 항원 단백질 용액을 준비합니다. 분자량에 따라 각 항원 단백질의 몰을 계산하고 비오틴 또는 Ru Sulfo-NHS의 적절한 몰비를 만드십시오. 비오틴 또는 Ru Sulfo-NHS의 합에 대한 항원의 비율은 프로 인슐린 단백질과 같은 소분자 항원 (분자량 ≤10kd)의 경우 1 : 5입니다. ZnT8과 같은 중간 분자 항원 (분자량 10-50 kd)의 경우 비율은 1:10으로 조정됩니다. GAD와 같은 큰 분자량 항원 (분자량 >50 kd)의 경우 몰비는 1:20입니다. 항원 단백질을 두 개의 동일한 부분으로 나누고 단계 2.1에서 계산 된 몰비를 사용하여 비오틴 및 Ru Sulfo-NHS와 별도로 혼합합니다. 혼합물을 실온(RT)에서 1.5시간 동안 배양하여 빛을 피합니다.참고: 항원 단백질의 완충액에 있는 트리스 또는 글리신과 같은 모든 환원 화학물질은 2x PBS(pH 7.9)의 완충액으로 프라이밍된 사이징 스핀 컬럼에 의해 제거되어야 합니다. 스핀 컬럼을 2x PBS로 프라이밍합니다(스핀 컬럼의 크기, 2mL 또는 5mL는 표지 항원 단백질의 부피에 따라 다름): 스핀 컬럼에 2x PBS 버퍼 1ml를 추가하고 1,000x g 에서 2분 동안 원심분리한 다음 단계를 2배 더 반복합니다. 항원 단백질-비오틴 또는 -Ru 설포-NHS 혼합물을 프라이밍된 스핀 컬럼 1x(컬럼을 1,000 x g 에서 2분 동안 원심분리)를 통과시켜 정제하고 표지 반응을 중지합니다. 스핀 컬럼으로부터 용출된 표지된 항원 단백질의 최종 부피를 측정하여, 비오틴- 또는 Ru Sulfo-NHS-표지된 항원 단백질의 농도를 계산한다. 표지된 항원 단백질(50μL/튜브)의 더 작은 분취량을 만들고 장기간 사용을 위해 -80°C에서 보관하십시오.참고: 각 스핀 컬럼 이후의 단백질 커버리지는 대략 90%-95%의 유지율입니다. 3. 6-Plex ECL 분석(바둑판 분석)을 위한 비오틴 및 Ru 설포-NHS 표지 항원에 대한 최상의 농도 및 비율 정의 참고: 각 항원에 대한 바둑판 분석은 다중 분석에 통합되기 전에 필요합니다. 각 항원에 대해 개별적으로 바둑판 분석을 적용하십시오.참고: 단계 3.2.-3.7. TGA를 간단한 예로 사용합니다. TGA 바둑판 분석 프로세스는 분석 프로세스를 시뮬레이션하는 것이지만 한 종류의 항원만 사용합니다. 비오티닐화된 tTG 및 Ru설포-NHS 표지된 tTG의 연속 희석을 확인한다. 첫 번째 혼합물 용액의 권장 작업 농도는 비오티닐화 및 Ru 설포-NHS 표지 tTG 모두에 대해 240ng/mL부터 시작합니다. 원래 비오티닐화 및 Ru 설포-NHS 표지 tTG의 농도가 모두 1.0μg/μL라고 가정합니다. 원래 Ru 설포-NHS 표지 tTG를 10배 희석하고 원래 비오티닐화된 tTG를 5% BSA로 5배 희석합니다. 4μL의 비오틴화 tTG 단백질과 156μL의 5% BSA(항원 완충액) 및 240μL의 스트렙타비딘 접합 링커를 하나의 튜브에 혼합하고 RT에서 30분 동안 용액을 배양합니다. 그런 다음 160μL의 정지 용액을 추가하고 RT에서 30분 더 배양합니다. 혼합물 400μL를 취해 정지용액 2mL와 혼합한다. 혼합물에서 비오틴화 tTG의 농도는 240 ng/mL입니다. 비오틴 표지 된 ZnT8 항원에 대한 연속 희석을 위해 5 개의 새로운 튜브를 추가로 준비하고 3.3 단계에서 혼합물에서 분취량 1mL를 취하십시오. 새 튜브에 정지 용액 1mL와 혼합하고 120ng/mL 농도의 혼합물을 얻습니다. 이 단계를 반복하고 연속 1:1 희석을 한 다음 60ng/mL, 30ng/mL, 15ng/mL 및 7.5ng/mL에서 비오틴 표지 tTG를 얻습니다. 4 μL의 Ru 설포 -NHS 표지 tTG를 1.6 mL의 정지 용액과 함께 첨가하고 240 ng / mL의 농도에서 Ru 설포 -NHS 표지 tTG의 혼합물을 얻습니다. 3.4.의 동일한 단계로 직렬 1 : 1 희석을하고 8 ng / mL, 60 ng / mL, 30 ng / mL, 15 ng / mL, 7.5 ng / mL 및 3.75 ng / mL에서 Ru 설포 -NHS 표지 ZnT3.75 항원을 얻습니다. 마지막 농도는 0ng / mL이며 정지 용액 만 있고 Ru Sulfo-NHS 표지 항원은 없습니다. tTG 양성 대조군 및 음성 대조군 혈청 샘플(단일 ECL tTG 분석으로 사전 검증 및 표준화)과 96웰 PCR 플레이트를 준비합니다. 양성 및 음성 대조군 혈청 샘플을 플레이트의 왼쪽 절반 및 오른쪽 절반에 각각 분취하고, 각 웰에 7 μL를 가한다. 웰당 33μL의 플레이트에 1x PBS를 추가합니다. PCR 플레이트의 왼쪽 절반에 연속 희석된 비오틴 표지 tTG-링커 용액 24μL를 각 웰에 추가하고 한 컬럼을 가장 높은 농도에서 가장 낮은 농도로 추가합니다. 같은 방법으로 연속 희석 된 Ru Sulfo-NHS 표지 된 tTG 항원 16μL를 각 웰에 첨가하고 한 줄에 한 농도로 한 줄을 넣은 다음 완전히 혼합합니다. PCR 플레이트의 오른쪽 절반에서 단계를 반복합니다. 5.3.-9.1단계에 설명된 나머지 분석 단계를 계속합니다. 원시 계수 데이터를 얻을 때까지. 포지티브 제어 신호와 해당 네거티브 제어 신호의 비율을 계산합니다. 음성 대조군 샘플에 대해 더 높은 비율 값과 더 낮은 배경을 가진 비오틴 표지 항원 및 Ru Sulfo-NHS 표지 항원에 대한 최상의 농도를 결정하십시오. 비오틴 및 Ru Sulfo-NHS 표지 항원 단백질의 최적 작업 농도는 다음과 같습니다 : GAD65의 경우 16.0 ng / mL 및 8.0 ng / mL, SARS-CoV-2 RBD의 경우 18.8 ng / mL 및 9.4 ng / mL, IA-42.0의 경우 42.0 ng / mL 및 42.0 ng / mL, tTG의 경우 60.0 ng / mL 및 60.0 ng / mL, ZnT8의 경우 4.2 ng / mL 및 4.2 ng / mL, 프로 인슐린의 경우 31.3 ng / mL 및 31.3 ng / mL입니다. 4. 링커 결합 항원 용액 생성 비오틴- 및 Ru 설포-NHS-표지된 항원을 단계 3.9에 따라 최적의 작업 농도로 5% BSA로 희석한다. 미리 선택된 링커를 각 비오틴화 항원 단백질에 결합시킵니다. 하나의 96웰 플레이트 분석의 경우 4μL의 비오티닐화 GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 및 프로인슐린 항원 단백질을 1% BSA 156μL가 포함된 별도의 튜브에 추가하고 240μL의 해당 스트렙타비딘 접합 링커 1, 2, 3, 8, 9 및 10과 혼합합니다(그림 1). 혼합물을 RT에서 30분 동안 인큐베이션한다. 각 튜브에 정지 용액 160 μL를 분취하고, 혼합물을 RT에서 30분 동안 인큐베이션한다. 각 튜브에서 400μL의 혼합 용액을 꺼내 함께 결합합니다. 위의 혼합물에 4μL의 Ru 설포-NHS 표지 GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 및 프로인슐린 항원을 추가한 다음 정지 용액 1.6mL와 1x PBS 3.2mL를 추가하고 혼합합니다. 이제 항원 용액을 분석에 사용할 준비가되었습니다. 5. 표지된 항원으로 혈청 샘플 배양 96-웰 PCR 플레이트에 대해 웰당 혈청 7μL를 분취하고, 밀봉 필름으로 덮는다. PCR 기계에서 혈청을 56°C에서 30분 동안 예열합니다. 플레이트를 100 x g 에서 1분 동안 간단히 원심분리합니다. 웰당 63 μL의 항원 용액(단계 4.4에서 제조됨)을 첨가하고, 혈청과 혼합한다. 빛을 피하기 위해 PCR 플레이트를 밀봉 호일로 덮으십시오. 플레이트를 셰이커 상에서 RT에서 450rpm으로 2시간 동안 흔든 다음, 플레이트를 4°C에서 18-24시간 동안 배양한다. 6. 6-플렉스 플레이트 준비 4°C 냉장고에서 6-Plex 플레이트를 꺼내 플레이트가 RT가 되도록 합니다. 150-Plex 플레이트의 각 웰에 3% 차단제 A 6μL를 추가합니다. 접시를 4°C 냉장고에 다시 넣고 빛을 피하면서 호일로 접시를 덮고 밤새 배양합니다.참고: 1일차의 분석 단계에는 섹션 4.-6이 포함됩니다. 7. 혈청/항원 배양물을 6-Plex 플레이트로 옮깁니다. 다음날, 냉장고에서 배양 6-Plex 플레이트를 꺼내 플레이트에서 모든 버퍼를 버립니다. 접시를 종이 타월에 두드려 말리십시오. 매번 웰당 150μL의 세척 완충액으로 6-Plex 플레이트를 3회 세척합니다. 플레이트를 종이 타월로 건조시키고, 분취량 혈청/항원을 밤새 인큐베이션 PCR 플레이트의 각 웰로부터 6-Plex 플레이트의 2개의 웰(중복의 경우 웰당 30μL)로 인큐베이션한다. 플레이트를 호일로 덮은 다음 플레이트를 플레이트 셰이커에 놓고 RT에서 450rpm의 속도로 1시간 동안 흔듭니다. 8. 6-Plex 플레이트를 세척하고 판독 버퍼를 추가합니다. 용액을 6-Plex 플레이트에 버리고 매번 웰당 150μL의 0.4M NaCl 세척 완충액으로 플레이트를 3x 세척합니다. 세 번째 세척이 완료된 후 종이 타월로 플레이트를 말리고 각 웰에 150μL의 판독 버퍼를 추가합니다.알림: 우물의 기포는 플레이트 리더 기계의 정확도에 영향을 미치므로 어떤 대가를 치르더라도 피해야 합니다. 9. 플레이트를 읽고 데이터를 분석하십시오. 전기화학발광 분석기에서 플레이트를 계수합니다. 판독 결과는 초당 카운트 (CPS) 값으로 표시됩니다. 각 특정 항체의 내부 표준 양성 및 음성 대조군의 CPS에 대해 판독기에서 얻은 원시 CPS를 사용하여 각 샘플의 상대 항체 지수를 계산합니다(인덱스 값 = [CPS(샘플) – CPS(음성 표준)] / [CPS(양성 표준) – CPS(음성 표준)]). ASK 연구에서 555 개의 음성 대조군 샘플의 99.5번째 에서 99.8번째 백분위 수에서 확립 된 컷오프 값을 사용하여 음성 또는 양성 항체 결과를 결정합니다 (당뇨병 또는 다른 유형의자가 면역 질환의 병력 또는 가족력이없는 모든 항체 음성 샘플).참고: 2일차의 분석 단계에는 섹션 7-9가 포함됩니다.