Un dépistage multiplexé à haut débit pour le diabète de type 1, les maladies cœliaques et la COVID-19

Le protocole de recherche a été approuvé par le Colorado Multiple Institutional Review Board. 1. Préparation du tampon Préparer le tampon d’étiquetage (2x PBS, pH 7,9) : Ajouter 100 mL de 10x PBS à 400 mL d’eau distillée et ajuster le pH en utilisant NaOH à 7,9. Faire 3 mM de biotine et de Ru Sulfo-NHS: Dissoudre 1 mg de biotine dans 588 μL de tampon de marquage et dissoudre 150 nmol de Ru Sulfo-NHS dans 50 μL de tampon d’étiquetage. Préparer le tampon antigénique (1% BSA): Dissoudre 5 g d’albumine sérique bovine (BSA) dans 500 mL de 1x PBS. Préparer le tampon de revêtement (bloqueur A à 3 %) : Dissoudre 15 g de bloqueur A dans 500 mL de 1x PBS. Préparer le premier tampon de lavage (0,05 % Tween 20, PBST) : Mélanger 2,5 mL de Tween 20 dans 5 000 mL de 1x PBS. Préparer le deuxième tampon de lavage (0,4 M NaCl) : Mélanger 50 mL de NaCl 5 M dans 575 mL d’eau distillée pour obtenir la solution de NaCl 0,4 M.REMARQUE: Pour un étiquetage efficace, utilisez toujours des solutions de biotine fraîchement préparées et de Ru Sulfo-NHS et non des solutions stockées fabriquées précédemment. 2. Marquage des protéines antigéniques avec la biotine et le Ru Sulfo-NHS séparément REMARQUE : Une concentration plus élevée de protéine antigénique ≥0,5 mg/mL est recommandée pour une plus grande efficacité de marquage. Préparer six solutions protéiques antigéniques ciblées, y compris la proinsuline, GAD-65, IA-2, ZnT8, TG et le domaine de liaison aux récepteurs (RBD) de la protéine de pointe du SRAS-CoV-2. Calculer les moles de chaque protéine antigénique en fonction de son poids moléculaire et faire des rapports molaires appropriés de biotine ou de Ru Sulfo-NHS. Le rapport de l’antigène à la somme de la biotine ou du Ru Sulfo-NHS sera de 1:5 pour les petits antigènes moléculaires (poids moléculaire ≤10 kd), tels que la protéine proinsuline. Pour les antigènes moléculaires moyens (poids moléculaire 10-50 kd), tels que ZnT8, le rapport s’ajustera à 1:10. Pour les antigènes de poids moléculaire de grande taille (poids moléculaire >50 kd), tels que le TAG, le rapport molaire sera de 1:20. Divisez la protéine antigénique en deux parties égales et mélangez-la séparément avec de la biotine et du Ru Sulfo-NHS en utilisant le rapport molaire calculé à l’étape 2.1. Incuber le mélange à température ambiante (RT) pendant 1,5 h, en évitant la lumière.REMARQUE: Tous les produits chimiques réducteurs tels que le Tris ou la glycine dans le tampon de la protéine antigénique doivent être éliminés par une colonne de spin de dimensionnement amorcée avec un tampon de 2x PBS (pH 7,9). Amorcez les colonnes de spin avec 2x PBS (la taille de la colonne de spin, 2 mL ou 5 mL, dépend du volume de la protéine de l’antigène de marquage): Ajouter 1 ml de tampon PBS 2x à la colonne de spin, centrifuger à 1 000 x g pendant 2 min, et répéter l’étape 2x plus. Laisser le mélange protéine-biotine antigénique ou -Ru Sulfo-NHS passer par la colonne de spin amorcée 1x (centrifuger la colonne à 1 000 x g pendant 2 min) pour la purification et arrêter la réaction de marquage. Mesurer le volume final de la protéine antigénique marquée éluée à partir des colonnes de spin, en calculant les concentrations de protéine antigénique marquée à la biotine ou au Ru Sulfo-NHS. Fabriquez de plus petites aliquotes de protéine antigénique marquée (50 μL/tube) et conservez-les à −80 °C pour une utilisation à long terme.REMARQUE: La couverture de protéines après chaque colonne de spin sera un taux de rétention d’environ 90% à 95%. 3. Définir la meilleure concentration et les meilleurs ratios pour les antigènes marqués à la biotine et au Ru Sulfo-NHS pour le test ECL 6-Plex (test en damier) NOTE: Le test en damier pour chaque antigène est nécessaire avant l’intégration dans le test multiplexé. Appliquez le test en damier pour chaque antigène séparément.REMARQUE : Étapes 3.2.-3.7. utilisera TGA comme bref exemple. Le processus de dosage en damier TGA consiste à simuler le processus de dosage, mais avec un seul type d’antigène. Faire la dilution en série du tTG biotinylé et du tTG marqué au Ru Sulfo-NHS. Les concentrations de travail recommandées de la première solution de mélange commencent à partir de 240 ng / mL pour le tTG biotinylé et marqué au Ru Sulfo-NHS. Supposons que les concentrations de tTG biotinylée d’origine et de tTG marquée au Ru Sulfo-NHS sont de 1,0 μg/μL. Faire une dilution 10x de la tTG originale marquée au Ru Sulfo-NHS et une dilution 5x de la tTG biotinylée originale avec 5% de BSA. Mélanger 4 μL de protéine tTG biotinylée avec 156 μL de BSA (tampon antigénique) à 5 % et 240 μL de l’agent de liaison conjugué à la streptavidine dans un tube et incuber la solution à TA pendant 30 min. Ensuite, ajoutez 160 μL de solution stop et incuber à TA pendant encore 30 minutes. Prendre 400 μL du mélange et mélanger avec 2 mL de solution d’arrêt. La concentration du tTG biotinylé dans le mélange est de 240 ng/mL. Pour effectuer une dilution en série de l’antigène ZnT8 marqué à la biotine, préparer cinq autres nouveaux tubes, prélever 1 mL d’une partie aliquote du mélange à l’étape 3.3. et mélanger avec 1 mL de solution stop dans un nouveau tube, et obtenir le mélange avec une concentration de 120 ng / mL. Répétez cette étape, faites des dilutions en série 1:1 et obtenez la tTG marquée à la biotine à 60 ng / mL, 30 ng / mL, 15 ng / mL et 7,5 ng / mL. Ajouter 4 μL de tTG marqué au Ru Sulfo-NHS avec 1,6 mL de solution stop, et obtenir un mélange de tTG marqué au Ru Sulfo-NHS à une concentration de 240 ng / mL. Avec les mêmes étapes de 3.4., faites des dilutions en série 1:1 et obtenez l’antigène ZnT8 marqué au Ru Sulfo-NHS à 60 ng / mL, 30 ng / mL, 15 ng / mL, 7,5 ng / mL et 3,75 ng / mL. La dernière concentration est de 0 ng / mL, avec une solution d’arrêt et aucun antigène marqué au Ru Sulfo-NHS. Préparer des échantillons de sérum de contrôle positif et de contrôle négatif (préqualifiés et normalisés par un seul test de tTG ECL) et une plaque de PCR à 96 puits. Aliquote les échantillons de sérum témoin positif et négatif dans la moitié gauche et la moitié droite de la plaque, respectivement, avec 7 μL dans chaque puits. Ajouter 1x PBS à la plaque, avec 33 μL par puits. Sur la moitié gauche de la plaque de PCR, ajouter 24 μL de la solution de liaison tTG diluée à la biotine en série à chaque puits, une colonne avec une concentration dans l’ordre du plus élevé au plus bas. De la même manière, ajoutez 16 μL de l’antigène tTG marqué au Ru Sulfo-NHS dilué en série à chaque puits, une rangée avec une concentration, puis mélangez soigneusement. Répétez l’étape sur la moitié droite de la plaque PCR. Continuez le reste des étapes de dosage décrites aux étapes 5.3.-9.1. jusqu’à l’obtention des données brutes de comptage. Calculer les rapports entre les signaux de contrôle positifs et les signaux de contrôle négatifs correspondants. Déterminer la meilleure concentration pour l’antigène marqué à la biotine et l’antigène marqué au Ru Sulfo-NHS avec des valeurs de rapport plus élevées et un fond plus faible pour l’échantillon témoin négatif. Les concentrations optimales de travail de la biotine et de la protéine antigénique marquée Ru Sulfo-NHS sont indiquées ci-dessous : 16,0 ng/mL et 8,0 ng/mL pour GAD65, 18,8 ng/mL et 9,4 ng/mL pour le SRAS-CoV-2 RBD, 42,0 ng/mL et 42,0 ng/mL pour l’IA-2, 60,0 ng/mL et 60,0 ng/mL pour la tTG, 4,2 ng/mL et 4,2 ng/mL pour le ZnT8, et 31,3 ng/mL et 31,3 ng/mL pour la proinsuline. 4. Créer une solution d’antigène couplée à un agent de liaison Diluer les antigènes marqués à la biotine et au Ru Sulfo-NHS avec 5% de BSA aux concentrations de travail optimales conformément à l’étape 3.9. Lier des agents de liaison présélectionnés à chaque protéine antigénique biotinylée. Pour un essai sur plaque à 96 puits, ajouter 4 μL de GAD65 biotinylé, de SRAS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 et de protéine d’antigène proinsuline dans un tube séparé contenant 156 μL de BSA à 1 % et mélanger avec 240 μL de liants conjugués à la streptavidine 1, 2, 3, 8, 9 et 10 correspondants (Figure 1). Incuber le mélange pendant 30 min à TA. Aliquote 160 μL de solution stop dans chaque tube et incuber le mélange à TA pendant 30 min. Prélever 400 μL de la solution de mélange de chaque tube et les combiner ensemble. Ajouter 4 μL de Ru Sulfo-NHS marqué GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 et antigène de proinsuline au mélange ci-dessus, puis ajouter 1,6 mL de solution stop et 3,2 mL de 1x PBS et mélanger. Maintenant, la solution antigénique est prête à être utilisée dans le test. 5. Incuber les échantillons de sérum avec l’antigène marqué Aliquote 7 μL de sérum par puits pour une plaque PCR à 96 puits et couvrir d’un film d’étanchéité. Préchauffer les sérums à 56 °C pendant 30 min sur une machine de PCR. Centrifuger brièvement la plaque à 100 x g pendant 1 min. Ajouter 63 μL de solution antigénique (préparée à l’étape 4.4) par puits, et mélanger avec les sérums. Couvrir la plaque PCR avec une feuille d’étanchéité pour éviter la lumière. Agiter la plaque sur un agitateur à 450 tr/min à TA pendant 2 h, puis incuber la plaque à 4 °C pendant 18-24 h. 6. Préparez la plaque 6-Plex Prenez une plaque 6-Plex du réfrigérateur à 4 °C, permettant à la plaque de venir à RT. Ajouter 150 μL de bloqueur A à 3% dans chaque puits de la plaque 6-Plex. Remettez l’assiette au réfrigérateur à 4 °C, couvrez la plaque de papier d’aluminium en évitant la lumière et incuber pendant la nuit.REMARQUE : Les étapes de dosage du jour 1 comprennent les sections 4.-6. 7. Transférer le sérum/antigène incuber dans la plaque 6-Plex Le lendemain, sortez la plaque d’incubation 6-Plex du réfrigérateur et videz tout le tampon de l’assiette. Tapotez l’assiette sur du papier absorbant pour la sécher. Lavez la plaque 6-Plex 3x avec 150 μL de tampon de lavage par puits à chaque fois. Sécher l’assiette sur du papier absorbant, et sérum/antigène aliquote incube de chaque puits de la plaque de PCR d’incubation nocturne dans deux puits de la plaque 6-Plex (30 μL par puits pour les doublons). Couvrir la plaque avec du papier d’aluminium, puis mettre la plaque sur un agitateur à plaque, et agiter à une vitesse de 450 tr / min à RT pendant 1 h. 8. Lavez la plaque 6-Plex et ajoutez un tampon de lecture Versez la solution dans la plaque 6-Plex et lavez la plaque 3x avec 150 μL de tampon de lavage NaCl 0,4 M par puits à chaque fois. Une fois le troisième lavage terminé, séchez la plaque contre le papier absorbant et ajoutez 150 μL de tampon de lecture dans chaque puits.REMARQUE: Les bulles d’air dans le puits affectent la précision de la machine de lecture de plaques et doivent être évitées à tout prix. 9. Lire la plaque et analyser les données Comptez la plaque sur un analyseur à électrochimiluminescence. Les résultats de lecture seront présentés avec les valeurs en comptages par seconde (CPS). Calculer l’indice relatif d’anticorps de chaque échantillon à l’aide du CPS brut obtenu à partir de la machine de lecture par rapport au CPS des témoins positifs et négatifs de l’étalon interne de chaque anticorps spécifique (valeur de l’indice = [CPS (échantillon) – CPS (étalon négatif)] / [CPS (étalon positif) – CPS (étalon négatif)]). Déterminer les résultats négatifs ou positifs en matière d’anticorps à l’aide des valeurs seuils qui ont été établies entre le 99,5e et le 99,8e percentiles de 555 échantillons témoins négatifs de l’étude ASK (tous les échantillons négatifs d’anticorps sans antécédents ou antécédents familiaux de diabète ou de tout autre type de maladie auto-immune).REMARQUE : Les étapes de dosage du jour 2 comprennent les sections 7 à 9.