针对 1 型糖尿病、乳糜泻和 COVID-19 的高通量多重筛查

该研究方案得到了科罗拉多州多个机构审查委员会的批准。 1. 缓冲液制备 制备标记缓冲液（2x PBS，pH 7.9）：将100 mL 10x PBS加入400 mL蒸馏水中，并使用NaOH调节pH至7.9。 制作 3 mM 生物素和 Ru 磺基-NHS：将 1 mg 生物素溶解在 588 μL 标记缓冲液中，并将 150 nmol Ru 磺基-NHS 溶解在 50 μL 标记缓冲液中。 准备抗原缓冲液（1%BSA）：将5g牛血清白蛋白（BSA）溶解在500mL的1x PBS中。 制备包衣缓冲液（3%阻断剂A）：将15g阻断剂A溶解在500mL的1x PBS中。 准备第一个洗涤缓冲液（0.05%吐温20，PBST）：将2.5 mL吐温20与5，000 mL 1x PBS混合。 准备第二个洗涤缓冲液（0.4 M NaCl）：将 50 mL 的 5 M NaCl 与 575 mL 蒸馏水混合，制成 0.4 M NaCl 溶液。注意：为了有效标记，请始终使用新鲜制备的生物素和Ru Sulfo-NHS溶液，而不是以前储存的溶液。 2. 分别用生物素和茹磺基-NHS标记抗原蛋白 注意：建议使用更高浓度的抗原蛋白≥0.5 mg / mL以获得更高的标记效率。 制备六种靶向抗原蛋白溶液，包括胰岛素原、GAD-65、IA-2、ZnT8、TG 和 SARS-CoV-2 刺突蛋白的受体结合域 （RBD）。根据其分子量计算每种抗原蛋白的摩尔数，并制作适当的生物素或Ru磺基-NHS的摩尔比。对于小分子抗原（分子量≤10 kd），抗原与生物素或Ru Sulfo-NHS的总和的比例为1：5。对于中等分子抗原（分子量10-50 kd），例如ZnT8，比例将调整为1：10。对于大分子量抗原（分子量>50kd），例如GAD，摩尔比将为1：20。 将抗原蛋白分成两个相等的部分，并使用步骤2.1中计算的摩尔比将其与生物素和Ru磺基-NHS分别混合。将混合物在室温（RT）下孵育1.5小时，避免光照。注意：抗原蛋白缓冲液中的所有还原性化学物质（如Tris或甘氨酸）都需要通过涂有2x PBS（pH 7.9）缓冲液的上浆离心柱去除。 用2x PBS灌注离心柱（离心柱的大小，2 mL或5 mL，取决于标记抗原蛋白的体积）：向离心柱中加入1ml 2x PBS缓冲液，以1，000 x g 离心2分钟，然后重复步骤2x。 让抗原蛋白-生物素或-Ru磺基-NHS混合物通过引资离心柱1x（将柱以1，000× g 离心2分钟）纯化并停止标记反应。 测量从离心柱洗脱的标记抗原蛋白的最终体积，计算生物素或Ru磺基-NHS标记的抗原蛋白的浓度。制作较小的标记抗原蛋白等分试样（50μL/管），并将其储存在-80°C下以供长期使用。注意：每个离心柱后蛋白质的覆盖率约为90%-95%。 3. 确定用于 6 重 ECL 测定（棋盘测定）的生物素和 Ru 磺基-NHS 标记抗原的最佳浓度和比例 注意：在整合到多重测定之前，每种抗原的棋盘检测是必要的。 分别对每种抗原应用棋盘测定。注意：步骤 3.2.-3.7。将使用 TGA 作为简短的示例。TGA棋盘格测定过程是模拟测定过程，但只有一种抗原。 连续稀释生物素化的tTG和Ru磺基-NHS标记的tTG。对于生物素化和Ru磺基-NHS标记的tTG，第一种混合物溶液的推荐工作浓度从240 ng/mL开始。假设原始生物素化和Ru磺基-NHS标记的tTG的浓度均为1.0μg/ μL.对原始Ru磺基-NHS标记的tTG进行10倍稀释，并用5%BSA稀释原始生物素化的tTG。 将 4 μL 生物素化的 tTG 蛋白与 156 μL 5% BSA（抗原缓冲液）和 240 μL 链霉亲和素偶联接头混合在一个管中，并将溶液在室温下孵育 30 分钟。然后，加入 160 μL 终止液，并在室温下再孵育 30 分钟。取 400 μL 混合物，与 2 mL 终止液混合。混合物中生物素化的tTG浓度为240ng/mL。 为了对生物素标记的ZnT8抗原进行连续稀释，请准备另外五个新管，在步骤3.3中从混合物中取出1mL等分试样。并在新管中与 1 mL 终止液混合，得到浓度为 120 ng/mL 的混合物。重复此步骤，进行连续 1：1 稀释，并获得 60 ng/mL、30 ng/mL、15 ng/mL 和 7.5 ng/mL 的生物素标记的 tTG。 将 4 μL Ru 磺基-NHS 标记的 tTG 与 1.6 mL 终止液一起，并获得浓度为 240 ng/mL 的 Ru 磺基-NHS 标记的 tTG 混合物。使用与 3.4. 相同的步骤，进行连续 1：1 稀释，并在 60 ng/mL、30 ng/mL、15 ng/mL、7.5 ng/mL 和 3.75 ng/mL 下获得 Ru 磺基-NHS 标记的 ZnT8 抗原。最后浓度为0 ng/mL，只有终止溶液，没有Ru磺基-NHS标记的抗原。 制备 tTG 阳性对照和阴性对照血清样品（通过单次 ECL tTG 测定进行预审和标准化）和 96 孔 PCR 板。将阳性和阴性对照血清样品分别分装到板的左半部分和右半部分，每个孔中各含 7 μL。向板中加入 1x PBS，每孔 33 μL。 在PCR板的左半部分，向每个孔中加入24μL连续稀释的生物素标记的tTG接头溶液，一根色谱柱的浓度按从高到低的顺序排列。以同样的方式，向每个孔中加入 16 μL 连续稀释的 Ru Sulfo-NHS 标记的 tTG 抗原，一行浓度，然后彻底混合。重复PCR板右半部分的步骤。 继续步骤5.3.-9.1中描述的其余测定步骤。直到获得原始计数数据。 计算阳性控制信号与相应负控制信号的比率。确定生物素标记抗原和Ru Sulfo-NHS标记抗原的最佳浓度，具有较高的比率值和阴性对照样品的背景。生物素和Ru磺基-NHS标记抗原蛋白的最佳工作浓度如下所示：GAD65为16.0 ng/mL和8.0 ng/mL，SARS-CoV-2 RBD为18.8 ng/mL和9.4 ng/mL，IA-2为42.0 ng/mL和42.0 ng/mL，tTG为60.0 ng/mL和60.0 ng/mL，ZnT8为4.2 ng/mL和4.2 ng/mL， 胰岛素原分别为 31.3 ng/mL 和 31.3 ng/mL。 4. 创建接头偶联抗原溶液 按照步骤3.9，用5%BSA稀释生物素和Ru磺基-NHS标记的抗原至最佳工作浓度。 将预选接头与每种生物素化的抗原蛋白结合。对于一项 96 孔板测定，将 4 μL 生物素化的 GAD65、SARS-CoV-2 RBD、IA-2、tTG、ZnT8 和胰岛素原抗原蛋白加入含有 156 μL 1% BSA 的单独管中，并与 240 μL 相应的链霉亲和素偶联接头 1、2、3、8、9 和 10 混合（图 1）。将混合物在室温下孵育30分钟。 在每个试管中等分 160 μL 终止溶液，并将混合物在室温下孵育 30 分钟。从每个试管中取出 400 μL 的混合物溶液并将它们混合在一起。 向上述混合物中加入 4 μL 标记的 GAD65、SARS-CoV-2 RBD、IA-2、tTG、ZnT8 和胰岛素原抗原的 Ru 磺基-NHS，然后加入 1.6 mL 终止液和 3.2 mL 1x PBS 并混合。现在抗原溶液已准备好用于测定。 5. 用标记的抗原孵育血清样品 将每孔 7 μL 血清分装到 96 孔 PCR 板中，并用密封膜覆盖。在PCR机上将血清在56°C预热30分钟。将板以100 x g 短暂离心1分钟。 每孔加入 63 μL 抗原溶液（在步骤 4.4 中制备），并与血清混合。用密封箔覆盖PCR板以避免光线照射。 在室温下以450rpm摇动板2小时，然后将板在4°C孵育18-24小时。 6. 准备 6 重板 从4°C冰箱中取出6-Plex板，使板进入室温。 向6-Plex板的每个孔中加入150μL的3%阻断剂A。 将板放回4°C冰箱中，用箔纸盖住板避光，孵育过夜。注意：第 1 天的检测步骤包括第 4.-6 节。 7. 将血清/抗原转入 6-Plex 板中孵育 第二天，从冰箱中取出孵育的 6-Plex 板，将所有缓冲液从盘子中倒出。将盘子拍在纸巾上晾干。 每次用 150 μL 洗涤缓冲液洗涤 6-Plex 板 3 次。在纸巾上干燥板，将等分血清/抗原从过夜孵育PCR板的每个孔中孵育到6-Plex板的两个孔中（重复每孔30μL）。 用箔纸盖住板，然后将板放在摇板器上，在室温下以450rpm的速度摇晃1小时。 8.清洗6-Plex板并添加读数缓冲液 将溶液倒入 6-Plex 板中，每次用 150 μL 0.4 M NaCl 洗涤缓冲液每孔洗涤板 3 次。 第三次洗涤完成后，将板用纸巾擦干，并向每个孔中加入 150 μL 读数缓冲液。注意：孔中的气泡会影响读板机的准确性，应不惜一切代价避免。 9.读取板并分析数据 在电化学发光分析仪上计数板。读数结果将以每秒计数 （CPS） 为单位显示值。使用从读取机获得的原始CPS与每种特异性抗体的内标阳性和阴性对照的CPS计算每个样品的相对抗体指数（指数值= [CPS（样品）-CPS（阴性标准）]/[CPS（阳性标准）-CPS（阴性标准）]）。 使用ASK研究中555个阴性对照样本（所有抗体阴性样本没有糖尿病或任何其他类型自身免疫性疾病病史或家族史）的第99.5至99.8百分位数处确定阴性或阳性抗体结果。注意：第 2 天的检测步骤包括第 7-9 节。